木奶果果皮多酚提取工艺优化及其体外抗氧化活性研究

张容鹄 夏义杰 窦志浩 何艾 谢辉 邓浩 冯建成

摘 要 研究木奶果果皮多酚水浴振荡辅助提取工艺及其体外抗氧化活性。在单因素试验基础上，采用响应面法优化木奶果果皮多酚的水浴振荡辅助乙醇提取工艺，并以VC为对照，对DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基清除能力进行探讨。结果表明：采用优化后的工艺条件，提取时间63 min、提取温度65 ℃、乙醇浓度66%、液料比42 ∶ 1（mL/g），木奶果果皮多酚提取量为31.2 mg/g，与模型预测值31.0 mg/g相近，最佳工艺实用性强。体外抗氧化活性实验表明，木奶果果皮多酚对于DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为12.3、2.35、0.141 mg/mL，最高清除率分别为90.6%、99.1%和61.9%，说明木奶果果皮多酚具有很强的抗氧化活性。

关键词 木奶果果皮；多酚；水浴摇床振荡辅助提取；响应面；抗氧化活性

中图分类号 TS201.1 文献标识码 A

Abstract The water bath shaking-assisted extracting technology was aimed to optimize and antioxidant activity in vitro of polyphenol from the pericarp of Baccaurea ramiflora Lour. was investigated in the study. The extracting technology was optimized using response surface methodology. The evaluation of antioxidant activity was carried out by DPPH， ABTS and superoxide anion radical scavenging assays in comparison to VC. The optimum extraction conditions were determined as 63 min， 65 ℃， 66% and 42 ∶ 1（mL/g）for extraction time， extraction temperature， ethanol concentration and liquid-material ratio， respectively. The experimentally observed yield of polyphenol under the optimized conditions was 31.2 mg/g on average， near the predicted value of 31.0 mg/g， showing the practicability of the optimized process. In DPPH， ABTS and superoxide anion free radical scavenging assays， the IC50 value of the polyphenol extracted from the pericarp of B. ramiflora Lour. were 12.3， 2.35 and 0.141 mg/mL， and the maximum scavenging rates was 90.6%， 99.1% and 61.9%， respectively. Moreover， these results revealed that the pericarp of B. ramiflora Lour. possessed strong antioxidant activity.

Key words Pericarp； Baccaurea ramiflora Lour； Polyphenol； Water bath shaking-assisted extraction； Response surface methodology； Antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.025

木奶果（Baccaurea ramiflora Lour.），也称水赖、麦穗、蒜瓣果，属大戟科木奶果属植物，为常绿乔木或灌木，生于低海拔至中海拔的山谷、山坡阴湿林中。本属约有80余种，分布于印度、马来西亚、缅甸、泰国、越南、老挝、柬埔寨、中国、印度尼西亚等国[1-2]。木奶果的木、果皮均可入药，Inta等[3]指出木奶果主要水煎口服，用于便秘和腹泻。彭朝忠等[4]收集记载其水煎服后具有解菌毒的功效。胡建香等[2]对西双版纳地区野生木奶果果实进行了成分分析：其果实可食率为49.2%、含水分84.7%、VC 1.57 mg/（100 g）、可滴定酸1.99%、总糖11.87%等。海南科研人员经过初步筛选，发现木奶果树皮具有抗肿瘤活性，但对木奶果果皮功能性成分尚未作深入研究[5]。

海南保亭野生木奶果味甘、性凉，肉晶莹透白，酸甜可口，解暑去热，是良好的饮品及酸味添加剂；果核姹紫嫣红，是天然的食用色素；果皮色黄易剥，含有酚类、抗菌类等多种功能性物质。天然多酚具有明显的清除自由基等抗氧化活性[6]，Usha等[7]从木奶果树叶中发现迷迭香素多酚具有明显抗炎和抗氧化活性，从诺丽果肉[8]、石榴果皮[9]、羊栖菜[10]、紫丁香[11]中提取的多酚均显示具良好的抗氧化活性。目前对于木奶果果皮多酚的提取工艺优化国内还未见报道。本试验以乙醇为提取溶剂，采用水浴振荡辅助法提取木奶果果皮中的总多酚，通过4组单因素试验确定条件范围，采用响应面法优化提取工艺，同时对木奶果果皮多酚的体外抗氧化活性进行探讨，为实现木奶果果皮废弃物功能性成分研究与开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试原料及处理 2014年6月15日于海南保亭南林乡采摘生长良好，外皮呈黄色的木奶果，超纯水清洗，取果皮于-50 ℃冷冻24 h，经真空冷冻干燥，粉碎过30目筛，密封贮藏于阴凉干燥处备用。

1.1.2 试剂及溶液 甲醇、乙醇、丙酮、碳酸钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、双氧水、过硫酸钾、磷酸二氢钾、邻苯三酚、三羟基甲基氨基甲烷等均为国产分析纯，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-双-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）（Sigma公司），没食子酸标准品（上海源叶生物科技有限公司）、VC标准品（上海源叶生物科技有限公司）、试验用水均为超纯水。

1.1.3 仪器与设备 SHA-C恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）、EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、HK5200超声波清洗器（上海汉克科学仪器有限公司）、LD4-2A台式低速离心机（北京众益中和生物有限公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、SHZ-DⅢ循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）、RV06-ML 1-B旋转蒸发仪（深圳市怡华电子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 木奶果果皮粉末→按比例与乙醇混合→水浴恒温振荡→离心→过滤→浓缩→冷冻干燥→定容→测定A760→计算含量。

1.2.2 多酚提取量测定 参考Drosou等[12]和唐远谋等[13]的方法略有改动。称取没食子酸标准品0.010 g，用蒸馏水定容到200 mL，得到0.05 mg/mL没食子酸标准溶液，配制2、3、4、5、6 μg/mL的系列标准浓度溶液，分别加入Folin-Ciocalteu试剂和碳酸钠溶液，摇匀后避光反应30 min，显色后在760 nm处测量吸光度。以没食子酸浓度（C）为横坐标，吸光度（A760）为纵坐标，绘制标准曲线。按1.2.1流程提取木奶果果皮多酚，适当稀释后，按上述方法测定A760，以每克木奶果果皮中没食子酸当量（mg/g）表示其多酚提取量。木奶果果皮多酚提取量计算公式为：

其中p为多酚提取量（mg/g）；C为根据标准曲线计算样品中多酚的质量浓度（μg/mL）；n为稀释倍数；V为溶液体积（mL）；W为称取木奶果果皮质量（g）。

1.2.3 单因素试验 称取木奶果果皮粉末1.0 g，150 r/min水浴摇床振荡，在一定条件下乙醇浸提，选取提取时间（0、15、30、60、90、120、150 min）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%和80%）、液料比（10 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、60 ∶ 1 mL/g）和提取温度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）4个因素，以木奶果果皮多酚提取量（p）为评价指标，进行单因素试验，各因素试验至少重复3次，取平均值。

1.2.4 响应面法优化试验 根据单因素试验结果，选取提取时间、提取温度、乙醇浓度和液料比4因素，3水平，以p为响应值，采用响应面法优化木奶果果皮多酚提取工艺，试验因素和水平编码如表1，各因素试验至少重复3次，取平均值。

1.2.5 体外抗氧化活性试验 以提取的木奶果果皮多酚为原料进行体外抗氧化活性试验，采用DPPH法[14]测定DPPH自由基的清除率；采用ABTS法[15]测定ABTS自由基的清除率；采用邻苯三酚自氧化法[16]测定超氧阴离子清除率。

1.2.6 半抑制浓度（IC50）计算[17] 将木奶果果皮多酚的不同质量浓度对DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基不同清除率作图，并进行线性拟合，根据拟合的线性方程，当清除率为50%所对应的多酚质量浓度即为IC50，以IC50值作为木奶果果皮多酚的抗氧化能力指标，该值越低表示抗氧化活性越强。

1.3 数据分析

采用SPSS Statistics 18分析单因素试验结果，采用Origin8.0作图，运用Design Expert 8.0.5建立响应面模型，并对试验结果进行参数优化及统计分析。

2 结果与分析

2.1 多酚含量标准曲线

以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1），其回归方程为：Y=0.118 4X-0.009，线性相关系数为R2=0.999 6，表明该方法下没食子酸浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 提取时间的选择 由图2可知，随着时间的变化，提取的木奶果果皮多酚出现先增加后降低的趋势，提取时间为60 min时，果皮多酚提取量最高达（25.1±0.6）mg/g。提取时间太短，多酚不能完全有效提取，提取时间太长，一方面多酚化合物会不断分解氧化，稳定性降低[13]，另一方面会增加过多色素、蛋白等杂质[18]，从而使多酚浸出效率有降低趋势。因此提取时间以60 min为宜。

2.2.2 乙醇浓度的选择 由图3可知，随着乙醇浓度提高，多酚得率呈先增加，后减小的趋势，在乙醇浓度为70%时，木奶果果皮多酚含量最高。这是由于极性相近，使得多酚脱离原本的物质基团而溶出，而当乙醇浓度继续增大，多酚与溶剂分子之间的相互排斥增强，多酚在溶剂中的溶解度下降，从而导致提取率降低[18]。因此，乙醇浓度以70%为宜。

2.2.3 液料比的选择 由图4可知，随着液料比增加，木奶果果皮多酚的含量呈先增加，后减小的趋势。当液料比为40 ∶ 1时，多酚含量最高。液料比增加可以使木奶果多酚物质充分与浸提液接触并向外溢出，利于多酚的溶出，但液料比到达一定量时，木奶果果皮多酚溶出达到平衡，此外，液料比过大会造成能量、溶剂的浪费，并增加浓缩步骤的成本和时间[9]。因此，适宜液料比为40 ∶ 1 mL/g。

2.2.4 浸提温度的选择 由图5可知，随着提取温度的升高，木奶果果皮多酚提取量出现先增加后稳定不变的趋势，当提取温度低于60 ℃时，木奶果果皮多酚提取量是明显增加，而当提取温度高于60 ℃时，多酚含量虽略有增加，但增加幅度很小，考虑到温度太高，会影响多酚化合物的活性，因此浸提的较适宜温度为60 ℃。

2.3 响应曲面法优化提取木奶果果皮多酚试验

2.3.1 响应曲面法试验结果及分析 根据Box-Behnken中心组合设计原理，以木奶果果皮多酚提取量（p）为响应值，以4因素3水平的响应曲面法优化乙醇提取木奶果果皮多酚工艺，结果见表2。采用Design Expert 8.0.5软件，对表2响应面分析方案和数据结果进行多元回归拟合，木奶果果皮多酚提取量（p）对浸提时间（A）、浸提温度（B）、乙醇浓度（C）和液料比（D）的二次多项式回归方程为：

p=-87.27+0.088A+1.85B+1.22C+0.624D-5.0×10-4AB+0.001 6AC-0.001 3AD+0.002 3BC-2.5×10-4BD+7.5×10-4CD-7.31×10-4A2-0.015B2-0.011C2-0.006 5D2

对木奶果果皮多酚的响应面试验数据进行方差分析，结果见表3。由表3可知，所得模型的F值为17.83，p<0.001，表示该模型高度显著。该模型拟合优度R2=0.946 9>0.9，R2越接近1，表明模型越能预测其响应值，因此该模型能解释94.69%响应值的变化；变异系数（CV）=1.78%，变异系数越小说明实验越精确、可靠性越高；失拟项p=0.057 8（p>0.05），表明该模型的纯误差不显著；模型的Adeq Precision=13.412，该值是模型信噪比的反映，Adeq Precision大于4即表明模型的响应信号足够强[19]，可以用来拟合试验结果。该模型一次项A、B、C、D和二次项 A2、B2、C2、D2均极显著（p<0.01），说明此4个因素对木奶果果皮多酚提取量均有极显著影响。本试验4个因素对木奶果果皮多酚提取量均有显著影响，其影响程度为：提取温度>提取时间>乙醇浓度>液料比。

2.3.2 各因素交互效应分析 液料比和乙醇浓度、液料比和提取温度的交互关系的等高线近似圆形，认为其交互作用不明显，此处不逐一列出。图6～9组图为乙醇浓度和提取时间、液料比和提取时间、提取温度和乙醇浓度、提取温度和提取时间的响应面图和等高线图，4个等高线图呈椭圆形，说明存在相互作用。

由图6可知，乙醇浓度和提取时间2因素相互作用对于响应值p的影响较为明显，且提取时间对于响应值的影响比乙醇浓度对于响应值的影响略大，响应值随着2因素的变化而变化到达顶点。

由图7可知，液料比和提取时间之间产生了交互作用，但其交互作用对于响应值的影响弱于乙醇浓度和提取时间的交互作用对于响应值的影响，且提取时间对于响应值的影响比液料比的影响略大，响应值随着2因素的变化而变化到达顶点，而后略有降低。

由图8可知，乙醇浓度和提取温度2因素交互作用等高线图接近圆形，说明两者相互作用影响不大，其响应值也是随着提取温度的增加和提取时间的延长出现最大值，其后又逐渐降低。

由图9可知，提取温度和提取时间2因素相互作用对响应值有一定影响，随着提取温度和提取时间的增加，响应值也在增加，到达顶点后，又逐渐降低。

在4组相互作用中，提取时间和乙醇浓度的交互作用对多酚提取量影响最大，其次是提取时间和液料比，而提取温度和乙醇浓度，以及提取温度和提取时间的交互作用对多酚提取量影响较小。

2.3.3 优化与验证 通过Design Expert 8.0.5软件分析，预测的最优提取工艺为：提取时间63.32 min、提取温度64.57 ℃、乙醇浓度65.95%、液料比41.75 ∶ 1（mL/g），为方便实际操作，将上述条件调整为：提取时间63 min、提取温度65 ℃、乙醇浓度66%、料液比42 ∶ 1（mL/g）。以调整后的条件进行实验测定，实际得到多酚提取量平均值为31.2 mg/g，与模型预测值31.0 mg/g，相对误差为0.6%，认为模型良好，响应面法优化所得工艺条件具有实用性。

2.4 木奶果果皮多酚体外抗氧化活性

由图10～12可知，在测定范围内，木奶果果皮多酚和VC对自由基的清除能力随着浓度的增加而增强，并呈一定的量效关系。对于DPPH·的清除能力，木奶果果皮多酚略低于VC；对于ABTS+·及超氧阴离子自由基（O2·- ）的清除能力，木奶果果皮多酚高于VC，表现出了极强的抗氧化活性。截取不同自由基清除率和浓度进行线性方程拟合，通过拟合出的线性方程计算得到，木奶果果皮多酚清除DPPH·的IC50为12.3 μg/mL，清除ABTS+·和O2·- 的IC50分别为2.35 μg/mL和0.141 mg/mL。

3 讨论与结论

木奶果果肉由淡黄色革质状果皮包被，醇甜可口，其果汁主要用于治疗便秘。目前已有研究表明木奶果树皮和树叶提取物可用于治疗关节炎和脓肿[20]。木奶果果皮是木奶果果实废弃物，其多酚提取工艺和抗氧化活性研究还鲜有报道[21]。本试验在单因素试验基础上，采用响应面法优化提取工艺，结果显示影响木奶果果皮多酚提取量的因素排序为：提取温度>提取时间>乙醇浓度>液料比。郑朋朋等[22]研究表明影响玛咖多酚提取量的因素主要是提取温度和提取时间，与本试验结果一致；而张丽斌等[10]研究表明在提取浓度、提取时间和液料比3个因素中，液料比是影响羊栖菜多酚提取量的主要因素。造成上述结果的原因主要是由于不同植物中多酚的种类和含量区别很大，因而在植物多酚提取条件优化中，应先通过单因素试验摸索条件范围，再采用响应面法优化提取条件，从而找到影响多酚提取量的关键因素。孟蕲翾等[8]以乙醇为提取溶剂，对诺丽果粉进行超声波辅助提取，多酚提取量为6.19 mg/g；本试验以乙醇为提取溶剂，采用水浴振荡辅助法提取木奶果果皮中的总多酚，多酚提取量为31.2 mg/g，结果提示在提取溶剂相同情况下，选择合适的辅助提取方法是增加多酚提取量的关键因素之一。

植物多酚具有较强的体外抗氧化活性[15，19-20]。Amin等[21]对木奶果果实甲醇粗提物，分别用氯仿和石油醚提取多酚，研究提取物清除DPPH自由基的抗氧化作用，结果显示氯仿和石油醚提取物清除DPPH·的 IC50分别为49.78、75.31 μg/mL；而本试验以乙醇为浸提剂，采用水浴摇床振荡法，提取的木奶果果皮多酚清除DPPH·的IC50为12.3 μg/mL，说明本方法提取的木奶果果皮多酚抗氧化活性更强。同时，本试验提取的木奶果果皮多酚清除ABTS+· 和O2·- 的IC50分别为2.35 μg/mL和0.141 mg/mL，说明木奶果果皮多酚具有极佳的抗氧化活性，提示木奶果果皮可以变废为宝，成为分离生物活性物质的潜在资源。

本实验在单因素试验基础上，采用响应面法优化木奶果果皮多酚的乙醇提取工艺，并以VC为对照，对DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基（O2·- ）清除能力进行探讨。结果表明：采用优化后的工艺条件，提取时间63 min、提取温度65 ℃、乙醇浓度66%、液料比42 ∶ 1（mL/g），木奶果果皮多酚类物质的提取量为31.2 mg/g，与模型预测值31.0 mg/g相近，工艺切实可行。抗氧化活性实验表明，木奶果果皮多酚对于DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的IC50值分别为12.3 μg/mL、2.35 μg/mL和0.141 mg/mL，最高清除率分别为90.6%、99.1%和61.9%，说明木奶果果皮多酚具有很强的抗氧化活性。该提取工艺操作简单，能耗低，提取的多酚抗氧化能力强，可为木奶果果皮资源化利用提供基础。

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