PK—15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定

李珣　陈思宇　胡传活　王晓晔

摘要：【目的】构建 PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库，为深入研究猪伪狂犬病病毒（PRV）与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA，采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA（ds cDNA），并对其进行均一化和Sfi I酶切处理。处理后的ds cDNA分别连接3种阅读框pGADT7-Sfi I载体，将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库，取三框cDNA初级文库进行混合扩增，通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率，最后收集文库细菌提取文库质粒。【结果】3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，文库实际扩增基数>150万CFU；一号和三号读码框的基因重组率均为100%，二号读码框的基因重组率大于93%。cDNA文库外源基因插入片段长度在500～3000 bp。cDNA文库质粒浓度约1.0 mg/mL，质粒收获量约3.0 mg。【结论】构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量，符合酵母双杂交筛选要求，可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制。

关键词： PK-15细胞；酵母双杂交；三框cDNA文库；均一化；猪伪狂犬病病毒（PRV）

中图分类号： S852.65 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）05-0726-05

Abstract：【Objective】Yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells was constructed， in order to lay the foundation for investigating interaction mechanism between pseudorabies virus（PRV） and its host cells. 【Method】Total RNA was extracted from PK-15 cells， and the full-length double-strand cDNA（ds cDNA） was synthesized using SMART and LD-PCR， which was ligated to three-frame expression vector pGADT7-Sfi I after nomalization and Sfi I digestion， respectively. The ligation product was transformed into Escherichia coli to construct primary three-frame expression cDNA library. Three primary cDNA libraries were mixed and amplified. The capacity and recombination rate of library were determined by titer test and PCR identification. Finally， all bacteria were collected to extract library plasmid. 【Result】The capacities of three reading frame libraries were 3.0×106， 2.0×106 and 2.0×106 CFU， respectively. The practical amplification base of library was more than 1.5 million CFU. The recombination rates of three frame libraries were 100%， more than 93% and 100%， respectively. The inserted fragment of exogenous gene was 500-3000 bp in length. The plasmid concentration of cDNA library was about 1.0 mg/mL， the plasmid yield was about 3.0 mg. 【Conclusion】The constructed yeast two-hybrid three-frame cDNA library of PK-15 cells has high capacity and recombination rate， so which meet the requirements of yeast two-hybrid screening， can be used to research interaction mechanism between PRV and PK-15 cells.

Key words： PK-15 cells； yeast two hybrid； three-frame cDNA library； normalization； pseudorabies virus（PRV）

0 引言

【研究意義】猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种猪急性传染病，主要引起妊娠母猪繁殖障碍、育肥猪生长停滞及哺乳仔猪死亡，死亡率最高可达100%（Klupp et al.，1995；Pomeranz et al.，2005；林俊等，2016），对全球养猪业造成巨大危害。PRV具有泛嗜性，能在多种体外培养的细胞内进行增殖，其中以PK-15细胞最敏感（殷震和刘景华，1997），但迄今为止关于PRV与PK-15细胞间相互作用的研究报道相对较少。酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的一种重要技术手段（李向阳等，2015），因此构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文庫，可为采用酵母双杂交技术筛选与PRV蛋白相互作用的文库蛋白奠定基础，对揭示PK-15细胞抵抗PRV复制的分子机制也具有重要意义。【前人研究进展】鉴于PK-15细胞培养过程中生长速率快，且细胞扩增倍数显著提高，常用作构建cDNA文库的宿主细胞（王国栋等，2013；李文良等，2016）。田宏（2003）对猪瘟病毒（Clssical swine fever virus，CSFV）及其全长cDNA在PK-15细胞中的增殖表达特性进行研究，结果发现CSFV石门株强毒株能适应PK-15细胞，其全长cDNA亦可转染PK-15细胞，并证实病毒RNA在转染早期表达量较低，经过多次传代可提高病毒的抗原产量。薛白（2012）利用PK-15细胞扩增PRV，成功构建了PRV microRNA文库，证实PRV致病过程中确有microRNA存在，且发挥着重要的调控作用。王国栋等（2013）构建了PK-15细胞cDNA T7噬菌体展示文库，初级文库滴度为2.0×105 PFU/mL，扩增后滴度高达6.0×1010 PFU/mL，经PCR鉴定其文库重组率为95.83%。张辉（2014）利用酵母单杂交技术将合成的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株，然后采用SMART合成PK-15细胞cDNA文库，将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株，通过同源重组在酵母细胞内构建酵母单杂交cDNA文库；同时验证了PK-15细胞源蛋白（AP2α2、Elf4和ISCU）表达水平对PCV2的复制调节作用，即Elf4和ISCU蛋白过表达能够显著增强PCV2的复制，而AP2α2蛋白过表达对PCV2的复制无显著影响。【本研究切入点】酵母双杂交cDNA文库是研究蛋白质相互作用的重要手段，但目前尚无PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建的研究报道。【拟解决的关键问题】通过构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库，进一步明确PRV与PK-15细胞间的相互作用关系，为阐明宿主细胞抵抗PRV复制的分子机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

PK-15细胞由广西大学动物科学技术学院动物解剖学实验室保存提供，RNA提取试剂TRIzol Reagent购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Lambda EcoT14I digest、250 bp DNA Ladder Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，cDNA文库构建试剂盒Make Your Own“Mate & Plate”Library System Kit、LD-PCR試剂盒Advantage 2 Polymerase Mix购自美国Clontech公司，Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit购自Evrogen公司，NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）试剂盒购自Qiagen公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 PK-15细胞总RNA提取及第一链cDNA合成

细胞单层铺满80%以上、细胞形态规则、状态良好时，弃去细胞营养液，按TRIzol Reagent说明进行细胞总RNA提取。用紫外分光光度计测定总RNA浓度，并经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量。然后取1.0 μg总RNA，参照SMARTTM cDNA Library Construction Kit 试剂盒说明合成第一链cDNA。

1. 2. 2 LD-PCR扩增双链cDNA（ds cDNA） 取2.0 μL第一链cDNA，参照Advantage试剂盒说明扩增cDNA。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min（每次循环增加5 s），共进行30个循环；最后68 ℃延伸5 min。取5.0 μL LD-PCR产物（ds cDNA）经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余ds cDNA置于-20 ℃保存备用。

1. 2. 3 ds cDNA均一化处理 扩增获得的ds cDNA按Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit说明以DSN（Duples-specific nulease）进行梯度稀释。电泳检测均一化效果，并进行产物回收。

1. 2. 4 ds cDNA的Sfi I酶切处理 用限制性内切酶Sfi I（A）和Sfi I（B）对ds cDNA进行双酶切，两端产生不对称黏性末端，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用膠回收试剂盒纯化回收。

1. 2. 5 ds cDNA去除短片段处理 使用CHROMA SPIN-1000柱除去ds cDNA中500 bp以下的片段，并以电泳检测去除效果。

1. 2. 6 初级cDNA文库构建 处理后的ds DNA与3种读码框pGADT7-Sfi I载体在16 ℃下连接14 h及4 ℃下连接4 h。3种连接产物分别采用电转化法转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后迅速加入SOC培养基并转移到新的离心管中，37 ℃下摇床（250 r/min）培养1 h。培养结束，取10.0 μL培养物进行10、100和1000倍稀释后，各取50.0 μL涂布在含Amp+抗性的琼脂培养基上，37 ℃培养12～16 h，计算总克隆数（CFU）=培养基上的克隆数/50.0 μL×稀释倍数×1×103 μL。剩余培养物加入甘油，-80 ℃保存。

1. 2. 7 初级cDNA文库扩增、PCR鉴定及质粒提取

3种读码框初级cDNA文库各取50万CFU混合扩增，接种到含Amp+抗性的LB培养基中，37 ℃培养过夜，扩增文库。然后根据pGADT7-Rec序列设计的特异性引物（5'-GGAGTACCCATACGACGTACC-3'和5'-TATCTA

CGATTCATCTGCAGC-3'），随机挑取48个克隆进行文库插入片段的多态性分析，以1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。用2.0 mL文库保存液洗脱菌落，收集菌液后采用NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）试剂盒提取质粒，并进行质粒浓度和质粒收获量统计。

2 结果与分析

2. 1 PK-15细胞总RNA提取结果

提取的PK-15细胞总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，能清晰观察到28S、18S及5.8S核糖体RNA特征性条带，条带规则且无明显拖尾现象（图1），28S和18S的亮度比约2∶1，表明总RNA没有降解，完整性较好，符合cDNA文库构建要求。

2. 2 ds cDNA合成与鉴定结果

利用SMART合成cDNA第一条链，再通过LD-PCR合成ds cDNA，取5.0 μL LD-PCR产物（ds cDNA）经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，ds cDNA片段主要分布在100～6000 bp（图2-A），说明不同大小和丰度的mRNA均得到有效反转录，符合cDNA文库构建要求。

2. 3 均一化ds cDNA鉴定结果

均一化处理后的ds cDNA也未呈现出特异性条带，电泳图为均匀的弥散带（图2-B），且所覆盖的片段长度范围与未均一化处理的ds cDNA相同。

2. 4 ds cDNA的Sfi I酶切及去除短片处理结果

利用限制性内切酶Sfi I对均一化ds cDNA进行酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，酶切产物均匀分布在200 bp以上（图3），且酶切完全，能满足构建cDNA文库的要求。

2. 5 cDNA文库插入外源基因片段长度、库容量及重组率检测结果

通过PCR检测插入的外源基因片段长度，结果如图4所示，插入外源基因片段长度在500～3000 bp。根据文库重组率计算公式：文库重组率（%）=有插入片段的反应个数/反应总数×100，得出一号和三号读码框的基因重组率均为100%，二号读码框的基因重组率大于93%。构建完成3种读码框cDNA初级文库，库容量分别为3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU。从3种读码框的cDNA初级文库中各取50万CFU混合扩增，得到文库试剂扩增基数>150万CFU。采用NucleoBond Xtra Maxi EF（MN）试剂盒提取质粒，其中质粒浓度约1.0 mg/mL，质粒收量约3.0 mg，表明所构建的三框cDNA表达文库具有较高的重组率和库容量，符合酵母双杂交筛选要求。

3 讨论

RNA的完整性和高纯度是构建cDNA文库的基础（Zhu et al.，2001；王晨等，2010）。本研究提取PK-15細胞总RNA，得到28S和18S核糖体RNA的亮度比为2∶1，有清晰的特征性条带，表明RNA的信息链完整，没有发生降解，可用于构建cDNA文库。常规的建库需在合成cDNA双链两端通过连接加上相同或不同的接头，以相应的酶切后再插入載体中。由于连接效率低，通常导致低丰度或较长的cDNA信息丢失而失去应有的代表性。为了避免丢失重要的cDNA信息，本研究采用由Chenchik等（1996）提出的SMART构建文库，利用SMARTTM cDNA Library Construction Kit试剂盒中的SMART引物与CDS引物分别包含的不同Sfi I酶切位点进行酶切，由于Sfi I酶的识别序列是CCGGNNNNN

CCGG，其中的5个碱基（NNNNN）为随机序列，即两个引物中间的5个碱基不相同。对分别带有不同引物的cDNA利用SMART进行扩增，并进行Sfi I酶切，得到不同黏性末端的cDNA，因此可定向地插入特定载体中，且保证生物信息的完整性。

在构建cDNA文库时，小片段cDNA比大片段cDNA更容易扩增。因此，克隆稀有表达基因较困难，不但其转录水平低，而且复杂性和转录成本较高（王艺磊和张子平，2003）。为增加稀有表达基因在cDNA文库中的出现频率，提高发现新基因的效率，本研究采用Trimmer-Direct cDNA Normalization Kit试剂盒，在cDNA复性时选择DSN降解ds cDNA。DSN热稳定性好，不会作用于单链DNA。DSN能有效去除高丰度的cDNA，且不损伤大片段cDNA，即要求文库中cDNA片段长度的覆盖范围与未均一化处理的相同（王淑红等，2008），从而提高文库中cDNA丰度的均一性。

评价一个完整cDNA文库的质量主要从两个方面进行：（1）文库表征性，即文库中反映来源细胞表达信息的完整度，可用文库的库容量来衡量。库容量是构建初级cDNA文库中独立重组子克隆数，其大小决定了文库的覆盖度是否完整。通常得到一个具备完整信息的cDNA文库至少需含有1×106 CFU的库容量（Ohara and Temple，2001）。本研究通过对构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库进行分析，发现3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0×106、2.0×106和2.0×106 CFU，均符合建库要求，保证了文库的覆盖度。（2）重组cDNA序列完整性，即基因的重组率和插入片段长度（王淑红等，2008）。细胞mRNA均由5'端非翻译区、编码区和3'端非编码区组成，构建文库的完整性必须要求重组cDNA片段足够长，且能反应基因本身的结构。本研究构建一号和三号读码框的每个菌落均有外源基因插入，二号读码框的基因重组率也大于93%，cDNA文库的插入片段均在500 bp以上，主要分布于500～2250 bp，说明文库具有较高的重组率和完整性。本研究还发现，构建三框cDNA文库是在单一cDNA文库的基础上使上游引物逐一添加1个新的碱基，让cDNA以3种读码框的形式进行表达，有效保证插入片段的正确表达产物能被筛选出来而不会遗漏，提高cDNA文库的表达率。

酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的有效技术手段之一，目前关于应用酵母双杂交研究病毒与机体间相互作用的报道逐渐增多（Pei et al.，2010；李向阳等，2015），但以酵母双杂交筛选PRV与宿主相互作用的报道较少。本研究采用SMART结合酵母双杂交的方法构建cDNA文库，不但在基因重组率和外源插入片段长度等方面符合cDNA文库的筛选要求，而且方法简单易行，所构建的质粒文库相对于噬菌体文库具有易扩增保存、无需体外包装、筛选方便等优点，为深入研究PRV与宿主细胞间的相互作用机制、病毒复制机制及其致病机理打下了基础。

4 结论

本研究通过SMART构建PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库，在库容量、基因重组率和外源插入片段长度等方面均符合cDNA文库构建要求，且方法简单易行，符合后续文库筛选要求，可用于深入研究PRV与宿主细胞间的相互作用机制、病毒复制机制及其致病机理。

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（責任编辑 温国泉）