EPHB6缺失突变del915-917对非小细胞肺癌体内转移的影响*

西安医学院第二附属医院中心实验室(西安 710038)

于　军　铁　茹　张学策　常　盼　赵　鸽△　陈宝莹▲



EPHB6缺失突变del915-917对非小细胞肺癌体内转移的影响*

西安医学院第二附属医院中心实验室(西安 710038)

于军铁茹张学策常盼赵鸽△陈宝莹▲

摘要目的：探讨EPHB6缺失突变del915-917对非小细胞肺癌(NSCLC)体内转移的作用。方法：定点突变EPHB6的表达载体pcDNA4-EPHB6-wt获得突变载体pcDNA4-EPHB6-del915-917，转染肺腺癌细胞A549，进而将细胞接种于NOD/SCID小鼠体内，通过转移灶计数、HE染色评价转移情况。结果：表达EPHB6-del915-917的NSCLC细胞体内转移显著强于表达野生型EPHB6-wt的细胞。结论：EPHB6的缺失突变del915-917促发NSCLC体内转移。

主题词癌，非小细胞肺肿瘤转移移码突变 @EPHB6

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中主要的病理类型，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌。约75%的NSCLC患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。NSCLC转移造成的术后易复发以及放、化疗失败，是患者存活率、治愈率得不到提高的根本原因[1]。生促红素人肝细胞(Erythropoiet in-producing hepatoma cell line，EPH)受体家族，与其配体Ephrin之间的信号传递介导了许多重要的生理和病理过程：如胚胎形成、神经发育、肿瘤的发生与转移等[2]。EPHB6是EPH家族的成员之一，以往的研究表明EPHB6与乳腺癌、神经母细胞瘤、前列腺癌等多种肿瘤的转移呈负相关。最近，我们通过基因测序技术，筛查EPHB6编码区的序列，发现了EPHB6的一个新的突变位点del915-917，该突变造成EPHB6分子缺失3个氨基酸。生物信息学分析表明，该突变可能会损害EPHB6的功能[3]。本研究拟在前期研究的基础之上，采用NOD/SCID小鼠，评价EPHB6-del915-917对于NSCLC细胞体内转移的作用，明确该突变的功能，为临床NSCLC的诊断和治疗提供新的切入点。

材料和方法

1EPHB6突变表达载体的获得将人EPHB6的cDNA编码区(base 833-3853 NCBI Accession No. NM_004445)克隆进入pcDNA4 To/myc/hisA表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。采用QuickChange XL定点突变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)对EPHB6的编码区进行缺失突变。突变反应以pcDNA4-EPHB6作为模板，上游引物为：5’- AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG，下游引物为：5’- CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT。

2细胞培养与转染A549细胞系采用含10 %胎牛血清的DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，于37℃、5 % CO2的孵箱中培养。细胞转染采用转染试剂Nanofectin(PAA， Austria)，操作按照说明书进行。pcDNA4(空载体)、野生型EPHB6表达载体(pcDNA4-EPHB6-wt)或突变性EPHB6表达载体与EGFP的表达载体(pcDNA3.1-GFP，表达绿色荧光蛋白EGFP)共转染。为了得到稳定转染的细胞，用700 μg/ml的G418(Sigma，St.Louis，MO，USA)和400 μg/ml的Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)进行筛选。并且，利用流式细胞仪FACS对EGFP表达阳性的细胞进行分选。对得到的稳定转染细胞采用Western blotting对于EPHB6的表达水平进行确认。

3Western blot按照我们以往报道的方法进行[4]。蛋白检测：一抗采用兔抗人 EPHB6 (1μg/ml，Santa Cruz，USA)，内参照actin检测采用小鼠抗人β-actin(40 ng/ml，Sigma，USA)。采用辣根过氧化物酶(HRP)耦联二抗， ECL法显色。

4体内迁移实验采用8～10周龄的NOD/SCID小鼠(第四军医大学实验动物中心)。在接种肿瘤细胞1 d之前，22只NOD/SCID小鼠，经过3.5 Gy的钴60照射1次。接种时，分别将3×105稳定转染的肿瘤细胞悬浮于200 μl PBS，经过尾静脉注射。接种后4周，处死小鼠，检测肺部的转移灶。通过检测肺部的肿瘤结节来判定转移的形成。并将小鼠的肺脏用4 %的多聚甲醛固定，HE染色观察。

5统计学方法利用SPSS 15.0软件进行数据处理，实验数据表示为均数±标准差，多组间两均数比较采用方差分析，两独立样本均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1EPHB6-wt组、EPHB6- del915-917在肺腺癌细胞系A549中的表达以pcDNA4为空载体对照，分别构建EPHB6-WT和EPHB6-del915-917表达载体，转染A549肺腺癌细胞，筛选得到稳定表达的细胞。Western blotting结果显示，EPHB6-del915-917和EPHB6-WT的表达水平稳定(图1)。将稳定转染的细胞用于后续的体内实验。

图1野生型(EPHB6-wt)和突变型(EPHB6-mut)

EPHB6在A549细胞中的表达

2EPHB6-del915-917促进A549细胞在NOD/SCID小鼠体内转移于NOD/SCID小鼠尾静脉分别注射EPHB6-wt的A549细胞(n=10)、EPHB6-del915-917的A549细胞(n=10)或空载体对照细胞(n=2)。在接种后1周，EPHB6-wt和EPHB6-del915-917组分别有1只小鼠死亡。因此，接种后4周，检查肺部的转移病灶时，EPHB6-wt和EPHB6-del915-917组分别只有9只小鼠。如图2所示，表达EPHB6-wt的细胞在小鼠体内形成的转移灶数目显著少于对照组或EPHB6-mutant组(P<0.05)。其中，EPHB6-WT组中，1只小鼠未发生转移；2只小鼠转移灶数为1；2只小鼠转移灶数为3； 3只小鼠转移灶数分别为4、5、8；仅有1只小鼠有30个转移灶。而EPHB6-mutant组中，多达4只小鼠分别产生了30个转移灶。图2A中横线为对应散点数据的中位数，从中位数的比较也可看出表达EPHB6-mutant的A549细胞的体内转移能力显著强于表达EPHB6-wt的A549细胞。大体解剖(图2B)和HE染色(图2C)的结构进一步证实了上述结论。

(A)NOD/SCID小鼠肺部肿瘤病灶数目；(B)NOD/SCID小鼠肺的照片，箭头指示为肿瘤病灶； (C)NOD/SCID小鼠肺的HE染色(×40)

图2NOD/SCID小鼠体内A549细胞的转移

讨论

本研究采用的非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(non-obese diabetes-SCID mice，NOD/SCID)小鼠作为肿瘤体内转移研究的模型。NOD/SCID小鼠具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷，且NK细胞活性低下、无循环补体、巨噬细胞和抗原提呈细胞功能损害等特性。NOD/SCID小鼠在肿瘤研究领域具有广阔的应用前景。本研究首次报道了EPHB6-del915-917促发NSCLC的体内转移。这一实验结果为明确EPHB6在NSCLC中的作用，特别是EPHB6突变的功能提供了直接的实验证据。

以往，我们报道EPHB6受体型酪氨酸蛋白激酶抑制非小细胞肺癌转移[4]。本研究发现，EPHB6的缺失突变，不但造成EPHB6分子在结构上缺失3个氨基酸，更重要的是造成EPHB6野生型分子原有的肿瘤转移抑制效应消失，而且EPHB6-del915-917还促发NSCLC细胞体内转移。推测，其机制可能为：①EPHB6-del915-917对于野生型EPHB6产生竞争性抑制，从而削弱EPHB6的转移抑制效应；②与野生型EPHB6不同，EPHB6-del915-917可能激活了促进肿瘤细胞转移的细胞信号转导通路。但这还需要实验验证。

许多基因的“质”和“量”与肿瘤的发生、发展、转移和预后关系密切。所谓“量”，就是基因的表达水平，所谓“质”就是该基因表达产物的结构和功能是否正常。我们以往在NSCLC的临床标本和细胞系中检测均发现，NSCLC中EPHB6表达水平降低，这与其启动子区的高甲基化水平有关[5-6]。即NSCLC中EPHB6发生“量”的降低；本研究中，EPHB6的突变造成其氨基酸序列的变化，也就是其结构，即“质”的异常，进而影响到其功能。我们课题组针对EPHB6开展的系列研究，一直是紧扣基因的 “质”和 “量”这两条主线而展开，并逐步深入的。筛查功能明确的EPHB6的突变有可能成为临床NSCLC早期诊断、判断预后，以及治疗方案制定的重要指标。但其临床应用价值，从很大程度上取决于该突变的发生频率，突变频率越高，其临床应用价值越大。因此，在本研究动物实验的基础之上，课题组将进一步筛查该突变在NSCLC患者标本中的发生频率，并与NSCLC的转移做相关性分析。

参考文献

[1]Serke M，Schönfeld N.Diagnosis and staging of lung cancer[J].Dtsch Med Wochenschr，2007，132(21)：1165-1169.

[2]Eph Nomenclature Committee (1997) Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands. The ephrins[J].Cell，1997，90：403-404.

[3]于军，铁茹，赵鸽，等.非小细胞肺癌中EPHB6基因突变的筛选和功能预测[J].山西医科大学学报，2014，45(7)：557-560.

[4]铁茹，胡浩，谷仲平，等.EPHB6受体型酪氨酸蛋白激酶抑制非小细胞肺癌转移[J].陕西医学杂志，2011，40(6)：650-652.

[5]铁茹，胡浩，谷仲平，等.EPHB6受体型酪氨酸蛋白激酶在非小细胞肺癌中高甲基化失活[J].山西医科大学学报，2011，42(3)：194-198.

[6]Müller-Tidow C，Diederichs S，Bulk E，etal.Identification of metastasis-associated receptor tyrosine kinases in non-small cell lung cancer[J].Cancer Res，2010，65：1778-1782.

(收稿：2015-09-17)

Del915-917，the deletion mutation of the EPHB6， promotes in vivo metastasis of non-small cell lung cancer in NOD/SCID mice

Experimental Center， Second Affiliated Hospital， Xi’an Medical University(Xi’an 710038)

Yu JunTie RuZhang Xueceet al

ABSTRACTObjective：To clarify the effects of del915-917， a deletion mutation of EPHB6， on the in vivo metastasis of NSCLC (non-small cell lung cancer) in NOD/SCID mice.Methods：Site-directed mutagenesis was performed from pcDNA4-EPHB6-wt to pcDNA4-EPHB6-del915-917， which was transfected into A549 lung adenocarcinoma cells. The cells were then injected into NOD/SCID mice. The metastatic status were evaluated by metastasis counting and HE staining.Results：Cells expressing EPHB6-del915-917 demonstrated significant higher levels of metastasis， compared with cells expressing EPHB6-WT. Conclusion：The deletion mutation del915-917 increased the metastatic capability of NSCLC cells in NOD/SCID mice.

KEY WORDSCarcinoma，non-small-cell lungNeoplasm metastasis Frameshift mutation@EPHB6

通讯作者：▲第四军医大学唐都医院放射科

【中图分类号】R734.1

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.02.002

*国家自然科学基金资助项目(30801385)

卫生部肿瘤个体化治疗分子诊断专项课题(W2013FZ20)

陕西省社会发展攻关课题(2014K11-01-01-07)

陕西省教育厅基础研究专项课题(14JK1616)

△西安交通大学第一附属医院麻醉科