黄色短杆菌产L-苏氨酸的中试发酵工艺研究

刘　超，贾召鹏，伏广好（山东阜丰发酵有限公司，山东莒南276600）



黄色短杆菌产L-苏氨酸的中试发酵工艺研究

刘超，贾召鹏，伏广好
（山东阜丰发酵有限公司，山东莒南276600）

摘要：对黄色短杆菌在发酵罐中产苏氨酸的发酵工艺进行研究。通过单因素试验确定了培养时间、温度、pH和接种量的最优条件。在单因素试验的基础上，利用正交试验确定发酵最优条件。结果证明：在最优试验条件下（温度30℃，pH 7，接种量10%），L-苏氨酸产率为12.14%。

关键词：黄色短杆菌；L-苏氨酸；发酵工艺

L-苏氨酸属于人体20种必需氨基酸之一，主要用于医药、食品及饲料领域，近年来需求量增长迅速［1］。在医药方面，L-苏氨酸可以抗脂肪肝，促进淋巴细胞分化成熟，保护细胞膜；在食品方面，L-苏氨酸可以作为食品强化剂，提高食品的营养价值，与葡萄糖共热产生的焦香味可以增香，一般与其他氨基酸合并用于强化谷物营养；在饲料方面，L-苏氨酸与赖氨酸、色氨酸和蛋氨酸一起列为4大饲料添加剂，主要用于未成年仔猪和家禽等的饲料［2］，并逐渐成为影响畜禽生产性能的主要限制因素［3］。微生物发酵法是目前生产L-苏氨酸的主要方法［4］，本文通过对本公司生产菌种的中试发酵工艺进行优化，期望可以降低后续实际生产中的能耗，增加公司利润。

1　材料与方法

1.1菌种

黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum），由本公司保藏。

1.2摇瓶培养基（200 m L）

蛋白胨2 g，酵母膏2 g，NaCl 1 g，pH 7.0，150 r/min，30℃培养15 h。

1.3发酵培养基（20 L）

蛋白胨200 g，牛肉膏200 g，酵母膏100 g，NaCl 100 g葡萄糖100 g，接种后转速300 r/min，气压0.1 MPa，每4 h采样分析。

1.4 L-苏氨酸含量测定

根据GB/T 21979-2008《饲料级L-苏氨酸》规定的方法测定L-苏氨酸含量。以每100 mL发酵液中含有L-苏氨酸的克数记为L-苏氨酸产率，作为实验中工艺优化的衡量指标。

1.5正交试验设计

选取发酵温度（A）、pH（B）和接种量（C）3个因素设计正交试验，正交表选用L9（34），试验水平为单因素试验时L-苏氨酸产率较高的条件，每个实验组重复3次。为了减少每次加样的系统误差，保证试验的随机性，试验时打乱试验编号顺序，抽签决定试验次序［5］。

以L-苏氨酸产率试验指标，测量接种44 h后的L-苏氨酸产率，重复试验后的L-苏氨酸产率平均值填入表中进行统计分析。

表1　发酵条件优化正交试验因素水平设计

2　结果与分析

2.1培养时间对L-苏氨酸产率的影响

按照10%的接种量将摇瓶中的种子接种于20 L发酵液中，在全自动发酵罐中进行中试试验。每隔4 h取样测定L-苏氨酸产率，44 h后结束培养。试验结果如图1所示：可以发现发酵44 h后L-苏氨酸产率达到最大为11.88%，随着培养时间延长，L-苏氨酸产率基本维持稳定，因此确定以后发酵均在44 h时终止。

图1　培养时间对L-苏氨酸产率的影响

2.2温度对L-苏氨酸产率的影响

温度对菌株的L-苏氨酸产率有较大的影响，从图2的试验结果可以看出：较低的温度限制了菌体的生长，导致L-苏氨酸产率较低；而当温度过高时，也会影响酶的活性，使L-苏氨酸产率降低，而且过高的温度容易滋生杂菌；当温度为30℃时，菌株L-苏氨酸产率可达最大为12%。

图2　温度对L-苏氨酸产率的影响

2.3接种量对L-苏氨酸产率的影响

选取体积分数为2%～14%的接种量进行试验，从图3可以看出：初始菌种量对L-苏氨酸产率有一定影响，接种量≤10%时，L-苏氨酸产率随着接种量的增加而增加，最高可达11.55%；但当接种量＞10%以后，L-苏氨酸产率不会继续提高。从成本和消耗方面考虑，生产中使用10%接种量较为适宜［6］。

图3　接种量对L-苏氨酸产率的影响

2.4 pH对L-苏氨酸产率的影响

pH影响微生物代谢的进行，受菌体生长速度、产物和副产物等多种因素影响，黄色短杆菌在生产L-苏氨酸的过程中常常因代谢导致发酵液pH下降，需要补充液氨来提高pH，液氨同时还可为转氨作用提供铵根离子。试验中通过实时监测实时调节，使pH维持在恒定水平，试验结果如图4所示：pH为7时L-苏氨酸产率最高达到11.59%；pH 6～7时L-苏氨酸产率差距不大。实际生产过程中液氨的价格为1 500～2 000元/t，维持较低的pH可以节省大量液氨，因此建议pH维持在6～7即可。

图4　pH对L-苏氨酸产率的影响

2.5发酵条件正交试验结果

以上单因素试验确定了几个试验较优条件：培养时间44 h，培养温度30℃，接种量10%，pH 7。正交试验选用3个因素（培养温度、接种量和pH），固定培养时间为44 h，试验水平选取最优水平及附近两点，试验结果见表2。

表2　发酵条件正交试验结果

根据直接分析法可以看出，5号实验组L-苏氨酸产率最高，达到了12.12%，最优实验组的条件为温度30℃，pH 7，接种量12%。极差分析可以看出温度变化对试验结果的影响较大，其次是pH，最后是接种量。根据极差分析法确定的试验条件为温度30℃，pH 7，接种量10%，没有包含在本次试验9个试验号中，因此追加验证试验，对直接分析法和极差分析法确定的两组试验条件进行比较，当接种量为10%时，L-苏氨酸的产率为12.14%，当接种量为12%时，L-苏氨酸的产率为12.12%。

从验证试验可以看出，极差分析法确定的试验条件L-苏氨酸产率最高，可以达到12.14%，高于5号实验组的L-苏氨酸产率（12.12%）和接种量单因素试验时的结果（11.55%），是本次试验的最优试验结果。

对试验结果进行F检验，温度因素F值3.461＜F 0.05（2，8）=4.46，认为选定的3个温度水平对试验结果没有显著性影响。诱导量和接种量的3个水平同样对试验结果没有显著性影响［7-8］。

表3　发酵条件正交试验结果F检验

3　结　论

本实验首先通过单因素试验确定了小罐发酵时黄色短杆菌产苏氨酸的最适培养时间、温度、pH和接种量。又通过正交试验对温度、pH和接种量3个因素进行分析，试验水平选取单因素试验中L-苏氨酸产率较高的3个水平。试验结果表明：极差分析法确定的最优试验条件为温度30℃，pH 7，接种量10%，在此条件下L-苏氨酸产率最高，可达到12.14%，并且3个因素选取的3个水平均对试验结果没有显著性影响。工业化生产时具体应用哪种分析方法确定的试验条件还要根据实际成本和产生利润决定［9］。

现在苏氨酸售价约为1万元/ t，年产能10 000 t的车间，L-苏氨酸产率每提高1%，就可以提高纯利润100万元/年。从试验结果来看，虽然各因素选取的水平对试验结果没有显著性影响，但几个因素作用相互叠加，可使最高L-苏氨酸产率与最低L-苏氨酸产率相差4.62%，对利润的影响较大。

参考文献：

［1］蔡友华，严杰能，陆最青. L-苏氨酸工业研究进展［J］.广东饲料，2013（12）：26-28.

［2］王峥，喻兵权，王仁华，等.日粮苏氨酸水平对生长肥育猪生长性能和屠宰性能的影响［J］.江西饲料，2013（4）：12-16.

［3］张思聪，张艳蕾，李福昌.苏氨酸的代谢及其营养生理作用［J］.饲料研究，2012（7）：14-16.

［4］张雪，闫继爱，于雷，等.含苏氨酸操纵子重组质粒的构建及其对大肠杆菌L-苏氨酸积累的影响［J］.微生物学报，2009，49（5）：591-596.

［5］梁飞豹.应用统计方法［M］.北京：北京大学出版社，2010：176-190.

［6］赖慧彪，刘峰. L-苏氨酸摇瓶发酵工艺的研究［J］.安徽农学通报，2012，18（23）：45-46，70.

［7］韦云威，徐军庆，高先领，等.黄色短杆菌B. 003产L-精氨酸发酵条件的研究［J］.食品与药品，2013，15（5）：305-307.

［8］雷剑芬.黄色短杆菌生产L-精氨酸发酵条件的优化［J］.发酵科技通讯，2009，38（3）：12-14.

［9］黄金，黄磊，谢希贤，等.利用响应面法优化L-苏氨酸发酵条件［J］.食品与发酵工业，2008，34（1）：39-42.

（责任编辑：朱小惠）

Pilot scale fermentation of L-threonine by Brevibacterium flavum

LIU Chao，JIA Zhaopeng，FU Guanghao
（Shandong Fufeng Fermentation Co.，Ltd.，Junan 276600，China）

Abstract：The conditions of L-threonine fermentation by Brevibacterium flavum were studied in this paper. The optimal culture time，temperature，pH value and inoculum volume were obtained by single factor experiment. On the basis of single factor experiments，the optimal fermentation conditions were obtained by orthogonal experiments. The results showed that the yield of L-threonine reached 12.14%under the optimized conditions（temperature 30℃，pH 7，inoculum volume10%）.

Keywords：Brevibacterium flavum；L-threonine；fermentation conditions

作者简介：刘超（1988—），男，山东临沂人，硕士，主要研究方向为生物发酵，E-mail：liuchao.789@163.com.

收稿日期：2016-03-18

中图分类号：TQ92

文献标志码：A

文章编号：1674-2214（2016）02-0103-03