新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2-氯丙酸酯拆分中的应用

关锋

（天津南开和成科技有限公司，天津 300270）

新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2-氯丙酸酯拆分中的应用

关锋

（天津南开和成科技有限公司，天津 300270）

New PEI modif ed resin immobilized lipase and its application in 2-chloropropionic acid ester split

目的：研究新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2-氯丙酸酯拆分中的应用。方法：使用新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶，并使用固化后的脂肪酶对2-氯丙酸酯进行拆分。结果：PEI在反应温度为34 ℃时对光学活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光学活性2-氯丙酸的效果最好。结论：对2-氯丙酸酯使用新型载体PEI修饰树脂固定化后的脂肪酶进行拆分能高效的获取光学活性的2-氯丙酸酯。

2-氯丙酸酯；脂肪酶；固化

2-氯丙酸酯作为农药、香料、医药的中间体，其沸点为149 ℃ at 760 mmHg，密度为1.081 g/cm3，分子式为C5H9ClO2[1]。对于医药来说只有具有光学活性的2-氯丙酸酯才是制药的关键成分，因此本文的主要目的就是使用新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶，并使用固化后的脂肪酶对2-氯丙酸酯进行拆分制备具有光学活性的2-氯丙酸酯，现将结果汇报如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文使用的脂肪酶主要为猪胰脂肪酶（PPL），使用的试剂主要有乙醇、二氯甲烷、2-氯丙酸酯、丙醇、磷酸二氢钠、邻苯二甲酸氢甲、酚酞、磷酸氢二钠、氢氧化钠。设备有搅拌器、恒温锅、干燥箱、色谱仪、离子检测器等。

1.2 实验方法

第一步配置溶液，使用磷酸氢二钠配置溶液A，使用磷酸二氢钠配置溶液B，将乙醇配置为95%的浓度，将氢氧化钠配置为0.05 mol/L浓度，将酚酞配成10 g/L的指示剂，使用A、B两种溶液在pH为6.0的情况下配成缓冲液，缓冲液与2-氯丙酸酯、PEI修饰树脂固定化脂肪酶在恒温器内进行震荡反应 形成反应液，定期进行取样。取2 ml的反应液滴入酚酞指示剂、氢氧化钠和乙醇，计算2-氯丙酸的生成量。使用物理吸附法对脂肪酶使用新型载体PEI修饰树脂进行固定化。物理吸附法的方法为使用活性炭、多孔玻璃、几丁质等吸附剂将脂肪酶吸附到PEI的表面进行酶固化处理[2]。

2 结果

PEI在反应温度为34 ℃对光学活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光学活性2-氯丙酸的效果最好，详情请见表1，表2。

表1 不同温度对2-氯丙酸的生成量比较

表2 固化与非固化脂肪酶对2-氯丙酸拆分作用

3 讨论

本文使用的物理吸附法相对于操作简单，无需过于复杂的操作环境，可重复利用载体，但具有结合不牢固、脂肪酶易脱落的缺点。经过固化后的脂肪酶活力不仅与其制备方法有关，载体的性质也会对其活性造成一定的影响。载体可以通过改变酶生活的微环境，对酶的构型造成影响。质量较差的载体不仅会对酶的生理结构造成严重破坏还可对酶的活性造成影响，使酶活性降低甚至失活。

温度之所以能对光学活性的2-氯丙酸酯的生成量造成影响，主要是因为温度可以影响脂肪酶拆分2-氯丙酸的效率，作为影响酶反应的主要因素温度，相关报道显示随着温度的升高，2-氯丙酸的转化率逐渐升高，但其具有最适温度，低于或者高于此温度都会对固定化的脂肪酶活性造成一定的影响[3]。反应时间也可对光学活性的2-氯丙酸酯的生成量造成影响，随着反应时间的推移，2-氯丙酸酯转化率成逐渐升高的趋势，转化率主要与2-氯丙酸酯和脂肪酶反应的速率有关，时间增加，反应的部分增加，反应的速率逐渐增快。

除了温度、反应时间可影响2-氯丙酸酯的转化率，pH、固化酶用量、固化脂肪酶的重复使用等也与2-氯丙酸酯的转化率有关。相关报道显示，随着pH的增加，2-氯丙酸酯的转化率逐渐升高，其主要的影响的是脂肪酶的解离状态，但pH逐渐增高，脂肪固化酶催化活性有所降低，但解离状态未发生明显变化因而2-氯丙酸酯的转化率仍维持在较高的水平。在适宜的pH下固化后的脂肪酶对2-氯丙酸酯的选择性较高，因而转化率也较高。固化酶的用量与2-氯丙酸酯转化率呈正相关，固化脂肪酶量增多与2-氯丙酸酯可进行反应的数目会增多导致转化率的升高[4]。对于已使用过的固化脂肪酶虽然其光活性仍较高，但并没有初次制备的固化脂肪酶活性高，因此对于已重复使用多次的固化酶其2-氯丙酸酯的转化率有所下降，相关报道显示在重复使用三次以上的固化酶对2-氯丙酸酯转化率下降较为明显。

本文数据显示PEI在反应温度为34 ℃对光学活性2-氯丙酸的生成量最佳，且固化后的脂肪酶拆分光学活性2-氯丙酸的效果最好。由此可见，对2-氯丙酸酯使用新型载体PEI修饰树脂固定化后的脂肪酶进行拆分能高效的获取光学活性的2-氯丙酸酯。固化后的脂肪酶可利用回收，且通过过滤或者离心等简单方法就可以进行回收，重复使用，降低了实验的成本。固定后的脂肪酶更容易装置成为酶柱状，加大反应面积，适用于大规模的工业生产。固化的脂肪酶与游离脂肪酶在稳定性、选择性上均有所提高。

综上所述，对2-氯丙酸酯使用新型载体PEI修饰树脂固定化后的脂肪酶进行拆分能高效的获取光学活性的2-氯丙酸酯，建议使用高效的吸附制备固化酶的方法，因单纯的制备方法可影响酶的重复使用次数和稳定性，不利于研究经费的控制。对于脂肪易溶于水的特性，不建议固化脂肪酶的制备过程在水相中进行操作。在制备过程中使用表面活化剂可提高2-氯丙酸酯的转化率。为提高2-氯丙酸酯的转化率，选择合适的温度、适宜的pH值、固化脂肪酶量、反应时间等对PEI修饰树脂固定化后的脂肪酶拆分2-氯丙酸酯均有促进作用。

[1] 金迪.脂肪酶的固定化及其在2-氯丙酸拆分中的应用[J].浙江工业大学，2014，36(11)：28～29.

[2] 金鑫.脂肪酶催化芳基丙酸酯水解立体选择性调控方法[J].浙江大学，2012，12(23)：152～153.

[3] 陈辉.产碱假单胞菌脂肪酶分子改造及拆分制备l-薄荷醇的研究[J].浙江大学，2014，08(06)：147～148.

[4] 刘涛. 磁性纳米颗粒定向固定化脂肪酶及其应用研究[J].华中科技大学，2015，03(24)：47～50.

(P-02)

Q814

1009-797X(2016)06-0058-02

A

10.13520/j.cnki.rpte.2016.06.020

关锋（1984-），本科，助理工程师，研究方向为固定化酶树脂载体的研发。

2016-02-18