胎儿生长受限对其肾脏发育的影响

王妍平，王冠，崔洪艳，张志坤



胎儿生长受限对其肾脏发育的影响

王妍平，王冠，崔洪艳，张志坤

【摘要】目的：探究胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）的宫内环境对胎儿肾脏发育的影响。方法：收集2009年11月—2011年12月于天津市中心妇产科医院产科因胎儿原因要求引产的11例FGR和同期12例非FGR死胎或死产胎儿的肾脏组织标本（所有标本的采集均征得患方的知情同意和院伦理委员会的认可），测量其质量和体积，应用TUNEL法分析肾脏组织细胞凋亡率，并对Bax和Bcl-2蛋白在凋亡细胞中的阳性表达率进行检测。结果：与非FGR组相比，FGR组胎儿的平均肾脏体积、质量和肾单位数目均明显下降（P＜0.01），而其细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。进一步检测发现，FGR组细胞内促凋亡蛋白Bax的阳性表达率明显增加（P＜0.01），伴随有凋亡抑制基因Bcl-2的阳性表达率显著降低（P＜0.01）。结论：生长受限的宫内环境可能通过促进细胞凋亡而影响胎儿肾脏发育，为将来进一步探讨FGR的分子机制和成人期疾病的发病机制提供了新的线索。

【关键词】胎儿生长迟缓；肾；细胞凋亡；原癌基因蛋白质c-bcl-2；原癌基因蛋白质类

作者单位：300100天津市中心妇产科医院

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：29-31）

孕期营养不良可能导致胎儿生长受限（FGR），并可对胎儿的远期健康造成一定负面影响[1]。在FGR环境中，为保护重要器官，血液被重新分布到心和脑等器官[2]，导致肾脏、肝脏和肌肉组织等发育不良，从而导致成人疾病的发生[3-4]。随着FGR模型在哺乳动物中的成功建立，学者们发现FGR与成年疾病的发生密切相关。且有研究发现在所有动物模型中肾脏损害普遍存在[5]。Keller等[6]研究表明FGR模型中肾单位数目减少高达50%，高血压患者肾小球体积增加1倍，这可能与肾单位数目减少后代偿性肥大和超滤导致肾小球体积增加有关。由于肾脏在体液平衡和血压调节中发挥重要作用，肾单位数目减少可能导致成人高血压和心血管疾病的发生[7]。然而，具体机制尚不完全清楚。本研究旨在通过分析FGR情况下胎儿肾脏凋亡细胞的数目，探究其与肾脏形态学改变的关系，进一步通过检测凋亡相关调节基因探讨FGR可能的发生机制。

1　对象与方法

1.1研究对象收集2009年11月—2011年12月于天津市中心妇产科医院产科引产的死胎或死产胎儿肾脏标本23例，其中包括11例FGR肾脏标本（FGR组）和12例非FGR肾脏标本（对照组）。FGR组中，并发胎盘早剥、胎死宫内3例，合并胎儿畸形（胎儿唇腭裂1例，膈疝1例）要求引产2例，因FGR要求引产6例。对照组中，胎儿唇腭裂4例，胎儿脑部发育异常1例，膈疝2例，软骨发育不全1例，食道闭锁2例，正常要求引产2例。本研究均征得患方的知情同意和我院伦理委员会的认可后采集娩出胎儿的肾脏标本，所有肾脏标本均无明显畸形。对收集的所有标本称质量后立即用福尔马林固定后测定肾脏体积。2组一般情况比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表12　组一般情况比较

1.2方法

1.2.1HE染色方法肾脏组织经乙醇脱水，石蜡包埋后制成4～6 μm厚的切片，再经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水合后进行HE染色。染色后的切片经乙醇脱水，二甲苯洗涤后于荧光显微镜（Nikon 80i，Nikon公司，日本）下观察。每一标本取20张切片，经2位经验丰富的病理学家盲法分析切片细胞的凋亡程度。

1.2.2TUNEL法检测细胞凋亡HE染色切片脱蜡入水，滴加蛋白酶K（20 μg/mL，Roche Diagnostics公司，瑞士），37℃孵育30 min，修复抗原。加入TUNEL反应液，即末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）缓冲液（0.3 U/μL）、生物素化的dUTP（0.2 mmol/L，Roche公司）、1×TdT缓冲液（Invitrogen公司，美国），37℃孵育1 h。然后滴加10%正常马血清封闭非特异性抗体，并加入抗生物素蛋白-生物素复合物（稀释度为1∶100，Vector Laboratories公司，美国），于室温下孵育1 h，最后使用辣根过氧化物酶底物二氨基联苯胺（DAB）对切片进行染色，荧光显微镜（Nikon 80i，Nikon公司，日本）下观察结果。随机选取共5个非重叠视野，计算凋亡细胞的比例。

1.3统计学方法应用PASW Statistics 18统计学软件进行统计分析。定量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本均数比较的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1FGR组和对照组出生体质量、肾脏质量、体积及肾单位数量的比较FGR组平均出生体质量、肾脏质量、肾脏体积以及肾单位数量均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表22　组胎儿出生体质量、肾脏质量及肾单位数目的比较（±s）

表22　组胎儿出生体质量、肾脏质量及肾单位数目的比较（±s）

组别　n出生体质量（g）肾脏质量（g）肾脏体积（mm3）肾单位数目（个）FGR组111 094±383　3.732±1.19　5.6±0.7　462 749±121 871对照组121 964±439　7.305±1.98　9.4±1.1　913 889±125 926 t（P）　5.037（0.007）5.173（0.007）3.037（0.006）7.261（0.008）

2.2肾脏组织细胞凋亡率以及Bax和Bcl-2蛋白在凋亡细胞中的阳性表达率染色阳性细胞细胞核呈黄色，视为凋亡细胞。以200倍高倍镜下观察，阳性细胞的细胞核呈棕黄色，见图1和图2（见后插一）。随机选择5个非重叠高倍视野计数1 000个细胞，记录2组的凋亡细胞数，结果显示FGR组肾脏组织凋亡细胞增加，高于对照组（t=3.013，P=0.002）。对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达结果分析发现，FGR组促进凋亡蛋白Bax的表达高于对照组（25.98±5.18 vs.10.55±0.78，t=2.981，P=0.005），而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达低于对照组（5.05±0.73 vs.23.63±2.17，t=3.002，P=0.003），差异均有统计学意义。

3　讨论

流行病学研究证实FGR与胎儿成人后的心血管疾病、高血压、胰岛素抵抗、2型糖尿病等密切相关[8]，并在腹主动脉僵硬、动脉顺应性降低、视网膜动脉痉挛和内皮功能障碍等血管畸形的发生中发挥重要作用[9]。在FGR环境中，器官的发育亦可受到影响，Barker等[10]发现处于缺乏营养的宫内环境，可使胎儿重要器官形态和功能发生改变，进而增加高血压和心血管疾病的风险。

动物实验表明孕期限制蛋白质摄入可造成子代FGR以及肾单位数目降低[11]。本研究从人类FGR胎儿着手，对其肾脏发育进行了研究，结果表明FGR组中，出生体质量、肾脏体积、质量及肾单位数目均显著降低。这与之前的动物实验研究结果相一致。这种形态学改变可能对其发育和功能产生影响。

不良宫内环境导致子代发生FGR，低出生体质量致使肾脏体积减少，肾单位数目降低，但相关的发生机制仍未阐明。有动物模型研究表明FGR子代的肾单位数目减少与肾脏细胞的凋亡改变有关。本研究探讨了人类FGR胎儿肾单位数目减少的相关机制。在器官和组织发育过程中，细胞凋亡是一个重要过程，异常的细胞凋亡可导致器官形态和功能的改变[12]。同样，在肾脏发育过程中，细胞过度死亡可引起肾单位受损，导致肾萎缩。本研究中FGR组凋亡细胞数目明显增加，可能导致肾脏体积和质量降低以及肾单位数目减少。Welham等[13]研究发现孕期低蛋白饮食大鼠的子代会发生高血压及肾单位数目的减少，这可能与FGR环境细胞凋亡增加密切相关。

Thornburg等[11]也使用子宫胎盘灌注不良模型，证实了肾单位数目减少和肾脏凋亡的相关性。作者首先进行了肾单位数目的对比来证实其减少与双侧子宫动脉结扎诱导的FGR有关。然后，验证了凋亡是子宫胎盘灌注不良所致的肾单位数目减少的分子机制。他们发现在FGR肾脏中重要的存活因子Bcl-2 mRNA表达明显减少，而死亡增强因子Bax表达增加，本研究与该研究有一致性，也发现促凋亡蛋白Bax表达明显增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，从而发生胎儿肾脏凋亡的增加，导致肾单位数量的永久性降低，证实了肾脏凋亡和FGR间的内在联系。

然而，FGR环境导致细胞凋亡增加的分子机制尚不明确。Bcl-2蛋白通过抵抗多种形式的细胞死亡，延长细胞寿命，使细胞数目不断增加，是细胞凋亡过程中一个关键的抑制调节因子[14]，而Bax虽亦属Bcl-2家族，但其功能与Bcl-2截然相反，其可诱导细胞凋亡并与Bcl-2发生寡聚化而抑制其活性[15-16]。细胞中的Bax蛋白不仅可自身形成同源二聚体，并易与Bcl-2蛋白形成异源二聚体，从而使Bcl-2失活。当细胞内Bax蛋白表达相对增多时，Bax同源二聚体增多，促凋亡作用增强。

本研究表明FGR胎儿通过改变凋亡相关基因的表达来增加凋亡，研究发现FGR组Bcl-2的表达明显下降，而Bax的表达明显上升，这样的基因表达可导致异常的细胞凋亡增加，从而使肾脏的形态学改变，影响其功能，进而导致成年期疾病的发生。这与Plank等[17]研究结果相一致。FGR胎儿的肾脏凋亡明显增加，导致肾单位数目降低，胎儿的肾脏体积减小，改变了肾脏的形态学发育。

综上，本研究结果提示细胞凋亡在FGR胎儿肾脏发育过程中可能有重要作用，有助于为进一步探讨FGR的分子机制和成人期疾病的发病机制提供新的线索。

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[本文编辑王昕]

Effects of Fetal Growth Restriction on the Development of Kidney

WANG Yan-ping，WANG Guan，CUI Hong-yan，ZHANG Zhi-kun.Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin 300100，China Corresponding author：ZHANG Zhi-kun，E-mail：zyliu03@163.com

【Abstract】Objective：To investigate the effect of intrauterine environment of fetal growth restriction（FGR）on the development of fetal kidney.Methods：Renal specimens of 11 fetal growth restriction（FGR）cases and 12 non-FGR cases were collected from November 2009 to December 2011 in the department of obstetrics of Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics.The mass and volume were calculated first，and the apoptosis rate of cells was analyzed by TUNEL.In addition，the positive expression rate of Bcl-2 and Bax proteins in apoptotic cells were also detected.Results：Compared with the non-FGR group，the average volume，quality and number of renal units were significantly decreased in the FGR group（P＜0.01）,while the apoptosis rate of cells was significantly increased（P＜0.01）.The positive expression rate of pro-apoptotic protein Bax in the FGR group cells was significantly increased（P＜0.01），with the expression rate of anti-apoptotic gene Bcl-2 decreased（P＜0.01）after future detection.Conclusions：Our study indicates that increased apoptosis may effect human kidney development in FGR environment，which is helpful to provide new clues for further exploring the molecular mechanism of FGR and the pathogenesis of adult diseases.

【Keywords】Fetal growth retardation；Kidney；Apoptosis；Proto-oncogene proteins c-bcl-2；Proto-oncogene proteins

基金项目：天津市卫生行业重点攻关项目（12KG128）

通信作者：张志坤，E-mail：zyliu03@163.com

收稿日期：（2015-09-06）