大鼠肝微粒体中睾酮及其代谢产物 6β -羟基睾酮的高效液相色谱检测方法的改进

赵燕燕，柳亚飞，刘丽艳，孙东，王静

(1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定　071002；2.河北大学药学院，河北保定　071002;3.河北大学医学实验中心，河北保定　 071000)



大鼠肝微粒体中睾酮及其代谢产物 6β -羟基睾酮的高效液相色谱检测方法的改进

赵燕燕1,2，柳亚飞1，刘丽艳3，孙东1，王静1

(1.河北大学化学与环境科学学院，河北保定071002；2.河北大学药学院，河北保定071002;3.河北大学医学实验中心，河北保定 071000)

摘要：建立快速、准确、灵敏的高效液相色谱法，对大鼠肝微粒体中的探针药物睾酮及其代谢产物6β-羟基睾酮进行准确定量分析，用于体外评价大鼠肝微粒体CYP3A酶的活性.对色谱条件进行优化，采用Durashell C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，体积比)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长245 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL.大鼠肝微粒体与睾酮标准品在37 ℃进行温孵，用固相萃取小柱对温孵产物进行萃取，用甲醇-水(体积比1∶1)复溶上机分析.6β-羟基睾酮和睾酮分别在0.05～10 mg/L和0.2～20 mg/L内线性关系良好(r>0.999 5)，检出限分别为0.003 4和0.034 mg/L(S/N≥3)，定量限分别为0.011和0.114 mg/L(S/N≥10)，加标回收率分别为100.1%和99.2%，相对标准偏差(RSD)分别为1.75%和1.13%.该方法符合生物样品测定标准.适合体外测定6β-羟基睾酮和睾酮含量，进而用于评价药物对肝微粒体CYP3A酶活性的影响.

关键词：大鼠肝微粒体；睾酮；6β-羟基睾酮；高效液相色谱法

细胞色素P450[1]混合功能氧化酶系统(CYP450)是最大的药物代谢酶蛋白超家族，它的CYP3A亚族是最重要的功能成分，不仅含量占CYP450总量的30%[2]左右，该酶还在许多内源性和外源性化合物的代谢中起着重要作用[3].CYP3A酶的活性可被一些药物抑制或诱导，其活性的改变，关系着药物在体内的代谢快慢、作用强度和毒性大小，因此准确评价药物代谢过程中对CYP3A酶活性影响具有十分重要的意义.

目前，国内外相关文献[4-6]大多选用睾酮作为CYP3A的探针底物，通过测定其在肝微粒体中的代谢产物6β-羟基睾酮(6β-hydroxytestosterone，6β-OHT)的含量变化，对该酶的活性进行评价.但睾酮在肝微粒体中的代谢产物较为复杂，目前文献报道的高效液相色谱检测方法多为梯度洗脱，检测物质多，分离度好，但操作和样品预处理方法过于繁琐[6-9]；等度洗脱方法难以实现对大鼠肝微粒体温孵体系中睾酮及其众多代谢产物的有效分离，色谱峰峰形较差[10]，无法对其进行准确定量，目标代谢产物6β-羟基睾酮保留时间较长，且存在检出限高、线性范围窄及灵敏度低[7，11]等问题；采用液-质联用[12]或超高效液相-质谱联用[13]对仪器设备要求较高.建立一种快速、稳定、灵敏度高，适合睾酮及其代谢产物6β-羟基睾酮的分离检测方法，并将其应用于体外CYP3A酶活性的评价及酶动力学的研究具有重要的现实意义.

1实验部分

1.1仪器与试剂

LC-20ATVP高效液相色谱仪(日本岛津公司)、SPD-20Avp紫外-可见检测器、LabSolutions工作站；ELx800全自动酶标仪(美国BIO-TEK公司)；PT2100台式均浆机(瑞士Times New Roman公司)；DELTA-320型酸度计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)；AUW120D十万分之一电子分析天平(日本岛津公司)；LSPE-12固相萃取装置(山东联众分析仪器有限公司)；Cleanert ODS C18固相萃取小柱(北京卓信伟业科技有限公司)；SK-1快速混均器(常州国华电器有限公司)；DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器(江苏太仓市实验设备厂).

睾酮(德国Dr.Ehrenstorfer公司，批号：10519)，制成质量浓度为200 μg/mL的标准储备液备用；6β-羟基睾酮(美国Cerilliant公司，批号：FN04141413)，质量浓度为100 μg/mL.还原型辅酶Ⅱ、二硫基赤藓醇、BCA蛋白检测试剂盒(均购自北京索莱宝科技有限公司).甲醇、乙腈为色谱级.磷酸氢二钠为分析纯.水为二次去离子水.

1.2实验动物

Wistar大鼠，体重(200±20)g，购自河北省实验动物中心，合格证号为SCXK(冀)2013-1-003.

1.3改进方法的色谱条件

Durashell C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，体积比)；流速为1 mL/min；检测波长为245 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL.

1.4肝微粒体制备、温孵实验及样品处理方法

实验动物禁食24 h，自由给水，脱颈处死后迅速取出肝脏，用钙沉淀法制备肝微粒体.BCA蛋白试剂盒测定大鼠肝微粒体蛋白浓度.

精密量取50 μL睾酮标准品溶液，缓和通N2吹干，加入甲醇-水(1∶1,体积比)50 μL复溶，加入适量肝微粒体使其终浓度为1 mg/mL，以磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)补足体积，温孵体系终体积为500 μL.进行温孵反应，固相小柱萃取法[7]处理样品，0.45 μm滤膜过滤，上机分析.

1.5酶动力学方程

在温孵体系中加入质量浓度为8～200 μg/mL的睾酮标准品，1 mg/mL肝微粒体，温孵时间30 min，按1.4节进行温孵实验和样品处理方法进行处理，按照1.3节色谱条件上机分析，测定温孵体系中睾酮剩余量，计算底物睾酮与肝微粒体酶反应的初速度，进行CYP3A酶代谢睾酮的酶动力学参数测定[14].

根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])，对其两边分别取倒数得Lineweaver-Burk方程：1/V=(Km/Vmax) ×1/[S]+1/Vmax.以1/V(Y，min/mg/μg)对1/[S](X，mL/μg)作图，进行线性回归.线性方程为Y=60.995X+0.322(R2=0.993)，方程截距的倒数即为酶催化反应的最大反应速率Vmax=3.106 μg/(min·mg)，方程斜率乘以Vmax即为米氏常数Km(酶促反应速率达最大值一半时的底物浓度)=189.450 μg/mL，Vmax/Km为内在代谢清除率Clint=0.016 mL/(min·mg).

2方法与结果

2.1色谱条件的改进

2.1.1流动相体系的选择

实验在参考相关文献[6,7]的基础上，考察了乙腈-磷酸溶液体系、乙腈-磷酸盐(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液体系、乙腈-NaH2PO4-三乙胺溶液体系、甲醇-乙腈-磷酸盐(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液体系为流动相时分别对6β-羟基睾酮和睾酮的分离度、保留时间及色谱峰形的影响.结果表明，以乙腈-(体积分数为0.05%磷酸)溶液体系为流动相，分析时间过长(tR>30 min)，且睾酮峰形严重拖尾；以乙腈-(10 mmol/L NaH2PO4)-(5 mmol/L三乙胺)溶液体系为流动相，各化合物保留时间显著缩短，睾酮峰形拖尾未改善，且需以磷酸溶液调节pH，操作繁琐；以乙腈-磷酸盐(NaH2PO4、Na2HPO4)溶液体系为流动相，6β-羟基睾酮与杂质峰难以达到分离；以甲醇-乙腈-(10 mmol/L Na2HPO4)溶液体系为流动相，睾酮色谱峰峰形尖锐对称，6β-羟基睾酮分离效果好(见图1)，故本实验选择其作为流动相体系.

1.6β-羟基睾酮；2.睾酮.图1　甲醇-乙腈-10 mmol/LNa2HPO4(pH 9.26，10∶32∶58，体积比)溶液体系为流动相色谱Fig.1　HPLC chromatograms of methanol-acetonitrile 10 mmol/L Na2HPO4 aqueous solution(pH 9.26，10∶32∶58，volume fraction)

2.1.2有机相加入比例的选择

实验考察了在甲醇-乙腈-10 mmol/L Na2HPO4溶液体系中甲醇-乙腈加入比例(0∶35、10∶31、10∶32、10∶33、10∶34，均为体积比)对6β-羟基睾酮和睾酮的分离度、保留时间及色谱峰形的影响.结果表明，在甲醇-乙腈加入比例为0∶35(体积分数)时，流动相洗脱能力强，各组分出峰时间短，但无法完全分离；随着甲醇加入比例的增加、乙腈加入比例的减少，各色谱峰保留时间逐渐延长，分离度增大；随着乙腈比例的调整，分离度不同，当甲醇-乙腈加入比例为10∶32(体积比)时，各化合物保留时间合适，6β-羟基睾酮与杂质峰达到基线分离，睾酮色谱峰峰形对称；继续增大乙腈加入比例，分离度降低.故实验选择甲醇-乙腈加入比例为10∶32(体积比)，再通过考察磷酸盐的种类和浓度进一步改善分离和峰形.

2.1.3 缓冲盐种类和浓度的选择

流动相中加入缓冲盐可增强其离子强度，减弱化合物中极性基团与色谱柱上残余硅羟基的结合，改善峰形.实验考察了NaH2PO4浓度在5～50 mmol/L、Na2HPO4浓度在5～20 mmol/L内对各色谱峰分离度、灵敏度、保留时间及色谱峰形的影响.结果表明，在上述不同种类及浓度磷酸盐条件下，6β-羟基睾酮的保留时间变化不大(波动<0.2 min)；6β-羟基睾酮的色谱峰分离度在10 mmol/L Na2HPO4盐溶液条件下达到最大值为1.641，同时睾酮色谱峰峰形最佳.不同种类及浓度的磷酸盐对色谱峰分离度及拖尾因子影响见表1.实验表明，在改善睾酮色谱峰的拖尾情况中，Na2HPO4磷酸盐优于NaH2PO4.综上，实验最终选择的磷酸盐溶液为10 mmol/L Na2HPO4.

表1　不同种类及浓度的磷酸盐对色谱峰分离度及拖尾因子影响

2.1.4pH值的选择

实验考察了流动相pH值(2.22～9.46)对各色谱峰的保留时间、分离度以及色谱峰形的影响.结果表明，随着pH值升高，对6β-羟基睾酮、睾酮色谱峰保留时间、分离度等影响不明显.当pH为9.26时，睾酮色谱峰拖尾因子T值为0.976，最接近1，满足色谱分析的要求.综上，实验选择pH值为9.26.

2.1.5柱温的选择

升高温度，可以加快分析速度、提高分离效率，在一定温度范围内还可增大柱效及改善色谱峰形[15].本实验考察了不同柱温(25、30、35、40、45 ℃)对各色谱峰保留时间、分离度、色谱峰形及理论塔板数的影响(见图2).结果表明，随着柱温的升高，色谱峰的保留时间明显缩短，但对分离度的影响不明显；柱温为30 ℃时，理论塔板数和拖尾因子(T=0.968，符合化学分析的要求)均达到最大值，柱温大于30 ℃时，理论塔板数明显减少.实验选择柱温为30 ℃.

图2　柱温对(a)保留时间、(b)分离度、(c)拖尾因子及(d)理论塔板数(N)的影响Fig.2　Effect of the column temperature on(a) retention time、(b)resolution、(c)tailing factor and(d) N

2.2方法专属性实验

分别量取6β-羟基睾酮和睾酮的混合标准品、空白(正常、灭活)肝微粒体、肝微粒体(正常、灭活)温孵睾酮和正常肝微粒体温孵睾酮样品中加入6β-羟基睾酮和睾酮的混合标准品溶液，按照1.3节色谱条件进样分析，色谱图见图3.结果表明，温孵反应得到的其他代谢产物在该色谱条件下均能与6β-羟基睾酮和睾酮色谱峰良好分离，说明所建立的HPLC法具有良好的专属性.

2.3方法学考察

2.3.1线性关系和检出限

精密量取6β-羟基睾酮和睾酮标准品储备液，用标准品溶剂逐级稀释，得到一系列质量浓度不同的溶液，各取50 μL置于10 mL离心管中，按1.4节温孵实验及样品处理方法进行处理，按照1.3节色谱条件进样分析，记录色谱图.分别以6β-羟基睾酮和睾酮的峰面积Y对质量浓度X(mg/L)作图，绘制标准曲线；按3倍信噪比(S/N≥3)确定检出限，10倍信噪比(S/N≥10)确定定量限.6β-羟基睾酮和睾酮的线性方程、线性范围、相关系数、检出限(LOD)及定量限(QOD)见表2.

表2　6β-羟基睾酮和睾酮的线性方程、线性范围、相关系数、检出限(LOD)及定量限(QOD)

Y：峰面积；X：质量浓度，mg/L；r2：相关系数.

2.3.2加标回收率

精密量取灭活肝微粒体温孵样品溶液，分别加入质量浓度为0.40，0.50，0.60 mg/L的6β-羟基睾酮和质量浓度为0.65，0.80，0.95 mg/L的睾酮标准品溶液.按1.4节温孵实验及样品处理方法进行处理，按照1.3节色谱条件进样分析，记录色谱图.取峰面积值计算加标回收率及RSD，6β-羟基睾酮和睾酮的加标回收率见表3.

1.6β-OHT；2.睾酮.a.混合标准品；b.正常肝微粒体；c.灭活肝微粒体；d.灭活肝微粒体温孵睾桐；e.正常肝微粒体温孵睾酮；f.正常肝微粒体温孵睾酮加标.图3　专属性液相色谱Fig.3　HPLC chromatograms of method specificity

物质质量浓度/(mg·L-1)加入量/(mg·L-1)低 中 高检出量/(mg·L-1)低 中 高加标回收率/%RSD/%6β-OHT00.40.50.60.410.490.61100.131.75睾酮00.650.80.950.640.800.9599.21.13

2.3.3精密度

精密量取正常肝微粒体温孵样品溶液，分别加入质量浓度为0.5，5.0，10.0 mg/L的6β-羟基睾酮和质量浓度为0.5，5.0，20.0 mg/L的睾酮标准品溶液.按1.4节进行温孵实验和样品处理方法进行处理，1.3节色谱条件进样分析，记录色谱图，计算日内精密度RSD.取上述溶液，上述方法连续测定3天，计算其日间精密度RSD，结果见表4.

表 4　6β-羟基睾酮和睾酮的日内和日间精密度(n=5)

2.3.4稳定性

精密量取灭活肝微粒体温孵样品溶液，分别加入质量浓度为0.5，5.0，10.0 mg/L的6β-羟基睾酮和质量浓度为0.5，5.0，20.0 mg/L的睾酮标准品溶液，分别在室温放置0、4、8、12、24 h及置于-70 ℃冰箱1、3、7、15、30 d解冻，按1.4节温孵实验和样品进行处理，按照1.3节色谱条件进样分析，其RSD值分别为0.7%～7.0%和2.3%～10%，符合生物样本分析要求.但如果在室温放置12 h或-70 ℃放置15 d内完成实验，其RSD值分别为0.7%～3.0%和2.3%～7%，结果会更好.

3讨论

本研究在优化改进文献方法的基础上，建立了快速、灵敏、准确测定肝微粒体温孵体系中6β-羟基睾酮及睾酮含量的高效液相-紫外检测方法，该方法适合体外实验中6β-羟基睾酮及睾酮的定量，为评价药物对CYP3A酶作用的影响及酶动力学研究提供简便、可靠的分析方法.流动相采用10 mmol/L Na2HPO4水溶液(pH 9.26)-乙腈-甲醇(58∶32∶10，体积比)，与文献[6-7]报道方法比较，本研究建立的色谱条件，运用等度洗脱使6β-羟基睾酮在6.34 min时检出，并且与杂质峰分离度高(R大于1.6)、睾酮色谱峰形尖锐对称.

药物代谢的主要器官是肝脏，药物在肝脏中进行生物转化则依赖于肝微粒体中的多种酶系，其中细胞色素P450酶在药物代谢中占有重要地位，CYP3A亚家族为CYP酶总含量的30%左右，据统计临床上有60%左右的药物经CYP3A催化代谢，该酶通过氧化许多内源性和外源性化合物参与生物体的代谢过程，如催化内源性物质睾酮的6β羟基转化.药物可通过抑制或诱导改变CYP3A酶的活性，而这严重影响药物在生物体内的代谢快慢、作用强度和毒性大小，如CYP3A活性被抑制时，使药物代谢减慢，作用虽有所增强，但不良反应和毒性相应增加，严重时可危及生命，因此临床必须准确评价药物在代谢过程中对CYP3A酶活性影响.评价酶的活性可运用探针药物的代谢率[16]推断药物对CYP3A酶活性产生诱导或抑制作用，或运用药物对酶的相对百分活性(%)[17]计算半数抑制浓度(IC50)进而判断药物对酶的抑制程度等级.本课题组将运用上述方法进一步研究中药甘草中主要有效成分18α-甘草酸和18β-甘草酸[18]对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响.

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(责任编辑：梁俊红)

Improvement on HPLC detection method of testosterone and it’s metabolite 6β -hydroxytestosterone in rat liver microsomes

ZHAO Yanyan1,2,LIU Yafei1,LIU Liyan3,SUN Dong1,WANG Jing1

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China；2.College of Pharmaceutical Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;3.Experimental Center of Medicine,Hebei University,Baoding 071000，China)

Abstract:A rapid,accurate and sensitive high performance liquid chromatography method was improved for accurate quantitative analysis of probe drugs testosterone and its metabolites 6β-hydroxytestosterone in rat liver microsomes,which was used in vitro to evaluate the activity of CYP3A enzyme in rat liver microsomes.Chromatography conditions were optimized,the experiment was carried out on a Durashell C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm),with 10 mmol/ L Na2H-PO4 solution(pH 9.26)-acetonitrile-methanol(58∶32∶10,V/V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelengthwas set at 245 nm.The column temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.Rat liver micro-somes and testosterone standards were incubated at 37 ℃,incubation products were extracted by solid phase extraction column,then reconstituted with methanol-water(1∶1,V/V) for HPLC analysis.6β - hydroxytestosterone and testosterone showed good linearities within 0.05～10 mg/L and 0.2～20 mg/L(r>0.999 5),respectively.The detection limits for 6β -hydroxytestosterone and testosterone were 0.0034 and 0.034 mg/L(S/N≥3)and the quantitative limits for 6β -hydroxytestosterone and testosterone were 0.011 and 0.114 mg/L(S/N≥10).The recoveries were 100.1% and 99.2% and the relative standard deviation(RSD) were 1.75% and 1.13% respectively.This method met the requirements of biological sample which was suitable for the quantitation of 6β -hydroxytestosterone and testosterone in vitro assays.Furthermore,with this method we could evaluate the impact of drug on the activity of CYP3A enzyme in liver microsomes and carry out the enzyme metabolism kinetics research

Key words:rat liver microsomes;testosterone;6β -hydroxytestosterone;HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.008

收稿日期：2015-06-25

基金项目：河北省自然科学基金项目(h1013201203)；河北大学医学学科专项资金建设资助项目(2014A1003)

中图分类号：O657.7

文献标志码：A

文章编号：1000-1565(2016)01-0043-09

第一作者：赵燕燕(1960—)，女，天津市人，河北大学教授，主要从事药学以及将现代分离技术用于临床、药学、食品、环境等方面的研究工作.E-mail：zhaoyany606@tom.com