生物传感器检测牛奶病原微生物的研究进展*

崔传金， 张　孔， 张瑞成， 田景瑞

(1.华北理工大学 唐山市先进测试与控制技术重点实验室，河北 唐山 063009；2.华北理工大学 唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)



综述与评论

生物传感器检测牛奶病原微生物的研究进展*

崔传金1， 张孔1， 张瑞成1， 田景瑞2

(1.华北理工大学 唐山市先进测试与控制技术重点实验室，河北 唐山 063009；2.华北理工大学 唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)

摘要:牛奶中病原微生物的含量是衡量牛奶质量的重要指标之一，生物传感器在牛奶病原微生物检测方面有较好的优势。介绍了生物传感器的组成和原理，并详细综述了近几年电化学生物传感器和质量敏感型生物传感器在牛奶中病原微生物的定量检测中的研究现状，探讨了未来的发展趋势。

关键词：生物传感器； 牛奶； 病原微生物； 检测方法

0引言

牛奶是一种营养成分较全、营养价值很高的生活必备食品,其质量关系到食品安全问题，评价牛奶质量最重要的一个参数就是菌落总数(total bacterial count，TBC)[1,2]，菌落总数是指每毫升牛奶中含有的细菌个数。理论上健康奶牛的牛奶中不含细菌，若奶牛患有乳腺炎疾病或外界污染，新鲜牛奶中就会存在细菌。牛奶中常含多种微生物[3]，其中，金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、结核杆菌等病原菌对牛奶质量及奶牛健康状况有较大的影响。各国都制定了牛奶中微生物含量的最高标准[2]，加拿大为TBC≤5×104cfu/mL，欧盟、新西兰和美国A级为TBC≤10×104cfu/mL，美国B级为TBC≤30×104cfu/mL，而中国标准最低，最新的GB 19301—2010规定：TBC≤200×104cfu/mL，是加拿大标准的40倍。

目前，有多种检测方法在牛奶病原微生物的检测中得到了应用[4],如，显微镜直接计数法、平板计数法(标准方法)、核酸扩增检测法、流式细胞计数检测法、光谱检测法、生物传感器检测法等。其中，生物传感器检测法具备灵敏度高、特异性好、检测准确、检测时间短、成本低廉、操作简单、能现场使用的优点，商业应用前景广阔。本文就生物传感器在牛奶病原微生物检测方面的研究和应用进展进行了综述。

1生物传感器构成与原理

生物传感器结合了物理学、信息科学、生命科学和分析化学等知识和技术，是多学科交叉的产物。其基本组成和原理如图1所示，主要由生物敏感膜(生物分子识别元件)和换能器两部分组成，生物敏感膜可以是酶、组织、全细胞、高分子聚合物模拟酶等，生物敏感膜可直接固定在换能器表面，但很多固定在换能器表面的基膜上(纳米薄膜等)，基膜在提高传感器性能、延长分子识别元件活性方面有重要作用；换能器可以是电极、热敏电阻器、光纤、压电晶体、微悬臂梁等。基本原理[5]为：待检测的物质通过扩散进入固定化生物敏感膜层，经过分子识别，发生生物学反应，产生电、热、光、声、质量等信息，然后被相应的换能器转变成可定量处理的电信号，再经信号处理，最后显示被测物质的浓度。

图1　生物传感器原理Fig 1　Principle of biosensor

2生物传感器在牛奶病原微生物检测中的应用

生物传感器在生物医学[6]、食品安全[7]和环境监测[8]等领域有广泛的应用前景。在牛奶病原微生物检测方面，电化学生物传感器和质量敏感型生物传感器的研究较多[9]，近几年的研究现状总结如下。

2.1电化学生物传感器

电化学生物传感器是以电化学传感器作为基础电极与生物活性材料组成的生物传感器。由于其具有换能器便宜，不受牛奶浊度的影响，传感器检测过程输出的电信号可直接在电路中转换等优点，不仅降低了仪器的复杂性而且有利于仪器的微型化和集成化。

Sireesha Chemburu等人[10]自主开发一种检测牛奶中大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、曲状杆菌含量的电化学酶联免疫生物传感器。该传感器采用双抗体夹心法，以高度分散的碳粒子固定抗体捕获牛奶样品中的病原微生物，辣根过氧化物酶标记的抗体再与病原菌特异性结合构成双抗体夹心结构，加入酶催化底物根据产生电流的大小与病原微生物的含量成比例的关系来检测病原菌的含量。牛奶样品中的大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、曲状杆菌的检测限分别为50，10，50 cells/mL，检测时间为30 min。Lin Y H等人[11]同样采用双抗体夹心法，制作了电化学酶联免疫生物传感器，用丝网印刷炭电极作为固相载体，并且用二茂铁二羧酸(FeDC)和纳米金对电极进行了修饰，起到电流信号的放大作用。对牛奶中大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)O157∶H7检测下限为50 cfu/strip，检测时间1 h。Vig Attila等人[12]也用类似非直接竞争酶联免疫的方法，用阻抗型免疫生物传感器检测了牛奶中黄曲霉毒素(aflatoxin M1，AFM1)的含量。在石墨丝网印刷电极(SPCE)上胶链AFM1的复合物，根据抗原—抗体免疫结合的原理，游离的AFM1与复合物上纳米金胶标记的AFM1抗体结合，电化学沉积得到的银离子用来放大检测信号，计算得到的电荷传递电阻Rct与AFM1的含量密切相关，检测范围为15～1 000 ng/mL，检测下限为15 ng/mL。

Zelada—Guillén G A等人[13]开展了基于核酸适配体的生物传感器检测牛奶中大肠杆菌的研究工作。该传感器的基本原理为：核酸适配体共价结合单壁碳纳米管修饰的电极，与牛奶样品中的大肠杆菌E.coli O157∶H7相互作用产生电压的变化，从而间接地检测出牛奶中细菌的含量，快速检测线性响应达到104 cfu/mL，响应时间短。Luo Caihui等人[14]也开展了基于核酸适配体的生物传感器检测牛奶中大肠杆菌E.coli O111的研究工作。该传感器利用巯基—金绑定方法将捕获探针锚定在金电极的表面，大肠杆菌的核酸适配体再通过与捕获探针杂交固定在金电极的表面。当加入大肠杆菌测时大肠杆菌与适配体剧烈作用适配体会从探针上脱离下来，形成的单链捕获探针会与标记有碱性磷酸酶的生物素化的检测探针杂交，对大肠杆菌产生非常敏感的酶催化的电化学响应，实现大肠杆菌的检测，传感器有很好的特异性。在牛奶中的检测限为305 cfu/mL，检测时间为3.5 h。

Laczka O等人[15]研制出一种检测牛奶中致病性大肠杆菌E.coli O157∶H7的电化学免疫传感器。基于检测辣根过氧化氢HRP酶在催化苯二酚(hydroquinone，HQ)介质中的过氧化氢(H2O2)时的活性的原理，并运用了微流控技术和微磁珠技术，通过检测电流的大小来检测病菌的含量，在牛奶样品的分析和检测中，检测限达到100 cells/mL，受其他杂菌的干扰较小。Esteban-Fernández devila 等人[16]应用电化学免疫传感器对牛奶中金黄色葡萄球菌检测进行研究。antiProtA抗体固定在ProtA修饰的磁珠上，与包括标记有HRP的抗原的物质进行竞争免疫测定。修饰的磁珠被磁场富集在四硫富瓦烯修饰的金印刷电极(Au/SPEs)的表面，加入H2O2后电极系统产生电流响应，这种传感器的检测限很低，在原奶中金黄色葡萄球菌的检测限可达1 cfu/mL，检测时间为2 h。汪学英等人[17]开展了“原位制备纳米功能化金电极传感器”检测牛奶中大肠杆菌的研究工作。根据纳米功能化薄膜对细胞膜上脂质过氧化反应具有显著的催化作用，而对细菌产生电流响应的原理，以计时电流法电流响应作为输出信号进行对细菌的测定，对实验数据分析得到在1.1×103～2.5×107cfu/mL的微生物检测范围内，响应电流和细菌数量呈线性关系。

Sung Yunju等人[18]利用基于抗体/纳米金/纳米磁珠复合材料的传感器检测牛奶中沙门氏杆菌。根据抗原—抗体免疫吸附原理捕获牛奶中的病原菌，根据过滤系统使得病原微生物富集，然后根据显色反应，根据颜色的不同实现检测目的，检测限为1.5×105cfu/mL，检测时间为40 min。

Wu Haiyun等人[19]应用免标记阻抗免疫电化学传感器对牛奶中布鲁氏菌含量进行快速定量检测。其原理为：根据电化学阻抗法，提取在金纳米丝网碳电极固定的布鲁氏菌及其抗体在界面处的信号，分析实验数据建立等效模型表示菌液和电极组成体系，并分析了模型中元件与菌液含量的关系，检测分析得出(40～400)×104/mL之间的布鲁氏菌与电极传递阻抗存在明显的线性关系，并实现了对牛奶样品中的布鲁氏菌的1×104/mL和40×104/mL检测，检测时间少于1.5 h。

周永军等人[20]基于电化学传感器设计了一种实时检测牛奶中含菌量系统。该系统基于细菌代谢过程和基质氧化还原机理设计制作电化学传感器，利用色素还原法通过对细菌氧化还原作用而生成的电子数计测，来实现对细菌数的测定。分析实验数据得到该传感器输出的电压与电流较好地反映了牛奶中细菌的数目，测量区间为103～1012cfu/mL，检测下限为103cfu/mL，测量时间10 min。宁毅[21]开展了基于碳纳米管生物传感器快速检测牛奶中甲型副伤寒沙门氏菌的研究工作。该传感器利用碳纳米管和以羧基荧光素修饰的具有双重检测功能的核酸探针，通过检测荧光值的增加和吸光度的增加可以对牛奶中甲型副伤寒沙门氏菌进行定量检测。分析实验数据可得,以荧光信号和吸光度所测出的最低检测下限分别为105，106cfu/mL。该方法同时利用两种信号来检测，提高了检测的准确性和可靠性，降低了假阳性信号产生的可能性。

2.2质量敏感型生物传感器

质量敏感型传感器主要有压电生物传感器和无线磁弹性生物传感器。压电生物传感器工作原理是：将生物活性物质固定于晶体表面，得到频率f1，将晶片置于被测的气体或液体中，当生物活性物质与被测物质发生反应形成复合物后，再测晶片的频率f2，从而得到Δf=f2-f1，再由Sauerbrey方程[22]Δf=-2.26×10-6f2Δm/A就可以得到被测物质的量。由于频率测定可以达到很高的精度，因此，可以有很高的检测限。无线磁弹性生物传感器工作原理是:在外加交变磁场中，传感器产生磁致伸缩。当外加交变磁场频率与传感器振动频率相等时，传感器产生共振，对应的振动频率为传感器共振频率。当传感器表面性质发生变化，其共振频率随之改变。其伸缩振动产生的磁通可由检测线圈检测到，从而实现无线传感[23]。

戴高鹏等人[24]以串联式压电传感器为基础构建了一台自动化微生物检测仪，实现了牛奶样品中金黄色葡萄球菌检测。其原理为:微生物分解牛奶改变其中的成分，从而改变液相体系中的电导介电常数等参数，进而改变频率的变化，从而测得牛奶中病原菌的含量。检测范围为10～106cells/mL，检测时间为3～15 h。后来用这种检测方法对含有大肠杆菌的牛奶样品进行检测研究，其检测范围仍可达到10～106cells/mL，且此方法准确度和平板计数法相当(r≧0.99)[25],但检测时间太长。Shen Zhiqiang等人[26]应用压电型生物传感器检测1 mL奶样中大肠杆菌E.coli O157∶H7含量。该传感器为石英晶体微天平(quartz crystal microbalance，QCM)免疫传感器，利用标记性免疫磁珠纳米粒子、金探针和含有E.coli O157∶H7的 mL奶样进行特异性结合，通过样品中金粒子的催化生长引起QCM表面质量变化，由质量变化引起谐振频率变化，从而检测出1 mL奶样中E.coli O157∶H7的含量，检测限为53 cfu/mL，重复利用率至少为10次，检测时间为4 h。结果表明，该传感器在检测牛奶中大肠杆菌含量方面具有高度专一性和稳定性。

Lakshmanan R S等人[27]应用磁弹性无线生物传感器对牛奶中沙门氏菌进行检测研究。该传感器的基本原理是：在选择层固定噬菌体，利用噬菌体捕获牛奶样品中的沙门氏菌，以此改变传感器传出的磁弹性频率，从而获得牛奶样品中沙门氏菌的含量，从实验数据得到其检测限为5×103cfu/mL，线性范围扩展到5×107cfu/mL，分析1 mL奶样用时20 min。实验结果表明：该传感器具有操作简单、灵敏度高、实时检测性强等优点，但是在稳定性、造价、避免牛奶抑制性影响等方面有待改善。Huang Sijing等人[28]研究制备了检测牛奶中金黄色葡萄球菌含量的磁弹性无线生物传感器。该传感器在密闭的容器内对牛奶样品的含菌量进行定量、实时的检测，牛奶样品中金黄色葡萄球菌含量改变，牛奶的粘度改变，导致传感器的共振频率变化，从而间接地检测出牛奶中金黄色葡萄球菌的含量，检测范围为103～107cells/mL。研究表明：该传感器在原位、远程实时和定量检测牛奶质量方面的可行性。黄思静等人[29]应用磁弹性无线生物传感器对牛奶中金黄色葡萄球菌开展研究工作。其共振频率随牛奶中金黄色葡萄球菌的细菌浓度的改变而改变，浓度可以通过传感器共振频率的增大或减小进行定量分析，线性范围104～107cells/mL，检出限为104cells/mL，且传感器的共振频率大小与菌液浓度呈线性相关关系，相关系数为0.98。

3结束语

本文综述了近几年电化学生物传感器和质量敏感型生物传感器在牛奶病原微生物检测方面的研究进展。其中，电化学生物传感器方面的研究较多，尤其是免疫型电化学生物传感器的研究最为丰富；质量敏感型生物传感器近年来也有一些研究，主要靠检测频率的变化来实现检测病原微生物含量的目的。另外，纳米技术和纳米材料在生物传感器上的应用，使电化学和质量型生物传感器检测的选择性和灵敏度都大幅度的提高。然而，大多数检测牛奶质量的生物传感器限于在实验室的研发，并且其识别元件的寿命、稳定性和非特异性结合方面依旧存在一定的局限性，不能完全实现对牛奶复杂体系的实时、在线、超灵敏自动化检测。

随着新型纳米材料的合成、加工和集成技术不断发展完善，芯片技术、微流控技术等将会在生物传感器中得到广泛的应用，不断提高传感器的性能。生物传感器技术的不断进步，必然在集成化、微型化方面有很好的体现，未来将会在牛奶病原微生物检测方面发挥重要的作用。

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Research progress of biosensor for pathogenic microorganism detection in milk*

CUI Chuan-jin1， ZHANG Kong1， ZHANG Rui-cheng1， TIAN Jing-rui2

(1.Tangshan Key Laboratory of Advanced Measurement and Control Technology,North China University of Science and Technology,Tangshan 063009,China;2.Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases,North China University of Science and Technology，Tangshan 063000,China)

Abstract:The content of pathogenic microorganism in milk is one of the important indexes of milk quality,biosensor has strong advantages in detecting pathogenic microorganism in milk.The composition and principle of biosensor are introduced,recent advances in electrochemical and quality sensitive biosensors used in pathogenic microorganism detection in milk in the past decade are reviewed in detail,together with a discussion of future development trends.

Key words:biosensor; milk; pathogenic microorganism; detection method

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)02—0001—04

收稿日期：2015—06—15

*基金项目：河北省自然科学基金资助项目(F2015209308)

中图分类号：TP 212.3

文献标识码：A

文章编号：1000—9787(2016)02—0001—04

作者简介:

崔传金(1982-),男，山东淄博人，博士，讲师，研究方向为生物传感器、测控技术与智能仪器。