适合银杏叶发酵的菌株筛选及发酵效果

林标声+吴江文+江火香+戴爱玲+杨小燕

摘要：研究了适合银杏叶发酵的菌株及其发酵效果。结果表明，银杏叶添加浓度为40%～50%时，地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌、产朊假丝酵母适合用于银杏叶发酵，其最佳的比例混合为2 ∶1 ∶1，最优的发酵工艺条件为接种量5%，含水量50%、发酵时间15 d，发酵温度30 ℃，与发酵前物料相比，发酵后银杏叶制剂菌株大量生长，产生乳酸，粗蛋白、氨基酸含量显著上升，提高了产品的益生菌含量、适口性及营养成分。

关键词：银杏叶；发酵菌株；筛选；地衣芽孢杆菌；嗜热乳杆菌；产朊假丝酵母

中图分类号： S182

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0315-03

银杏（Ginkgo biloba L.）是世界上最古老的孑遗植物，为中国特有珍稀树种，分布广泛，资源丰富。银杏的药用价值主要体现在叶和果实上，我国宋朝时民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎[1]等疾病。自20世纪60年代起，国内外学者对银杏叶的化学成分、药理作用、药物功效等进行了大量的相关研究，结果表明，银杏叶化学成分复杂，种类较多，许多成分具有重要的生理功能及活性[2]。到目前为止，从银杏叶中分离出的化学活性成分有160余种，包括银杏黄酮类、有机酸类、萜内酯类、烷基酚酸类、银杏酚类、醇类及甾类等[3]。银杏叶的食用安全性也较高，目前，以银杏叶及提取物为原料的药物和保健食品等已经大量上市。特别是近年来银杏叶作为饲料添加剂，在畜禽饲养方面有了一定的运用，能起到促进畜禽肠胃吸收、促生长、增强免疫力等功效，其作为一种新型饲料添加剂在畜牧业中具有广阔的开发应用前景[4-5]。银杏叶的相关开发，主要以银杏叶提取物为主，但银杏叶提取物的传统溶剂浸提法既造成了大量有效成分的损失，也无法保证产品的纯天然性[6]。而利用微生物发酵银杏叶制成微生物发酵剂，既克服了传统方法的缺点，又使银杏叶功效成分得到更好的直接释放[7]。从国内外资料调查可知，银杏叶在畜牧业上的应用还很少，特别是将银杏叶微生物发酵剂开发及作为饲料添加剂在生猪中的应用还未见报道，可能是银杏叶制剂的相关成分对微生物有一定的抑制作用，限制了银杏叶发酵制剂的研制与开发[8-9]。因此，本研究以银杏叶为发酵基质，通过筛选适合银杏叶发酵的优良菌株，优化其配伍组合，考察其发酵效果，为将来进一步开发出操作易行、装置简易且成本低廉、营养丰富、适口性好的银杏叶发酵制剂产品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

银杏叶购自市场，在60 ℃烘干后粉碎，过20目筛备用，装入自封袋密封保存。

初始菌株来源：市场购买的各畜用复合微生物发酵剂冻干菌粉（包括酵母菌，双歧杆菌、嗜热乳杆菌，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等），各有效菌活性乳酸菌含量≥20亿/g。

1.2 方法

1.2.1 银杏叶发酵的整体工艺流程

1.2.2 银杏叶发酵发酵菌株的筛选 银杏叶发酵液与发酵菌株培养基的配制：将银杏叶粉碎后，过筛40～50目，短时瞬间高温蒸煮，配制出浓度为300～600 mg/mL溶液加入到适合各菌生长的培养基中，作为筛选培养基。

分别取1 g复合菌剂于9 mL无菌水中，振荡15 ～20 min 后，适当稀释。分别取0.1 ～0.2 mL稀释液于筛选培养基中，酵母菌采用YPD培养基，乳酸菌采用MRS培养基，芽孢杆菌采用菌液60 ℃加热15～20 min 后涂布于LB培养基中。培养观察不同浓度银杏叶条件下各菌长势，挑选生长旺盛、形态完整的菌株作为选定菌株。经形态、显微、生理生化鉴定，最终确定适合银杏叶发酵的微生物菌株类型及属性。

1.2.3 发酵菌株最适合菌株配比、接种量的筛选 将所筛选的各菌均培养至10亿～100亿个/mL，各均按设定的比例取量混合，总菌量再按物料总量4%～5%的比例接入到35～37 ℃ 温水中搅拌、活化20～30 min，温水中含总发酵物料 80～100 mg/mL 红糖。菌株活化后，与银杏叶450～480 mg/mL、硫酸铵40～50 mg/mL、维生素C 1～2 mg/mL，硫酸钾 1～2 mg/mL混合均匀，并补充水分至450 mg/mL，用装量1～2 kg呼吸膜包装、密封，常温（25 ℃）生料发酵12 d，发酵后检测各项指标，选定最合适的菌株组合比例。各菌比例及接种量按表L827正交试验表安排进行。

1.2.4 银杏叶发酵工艺条件的优化 将所筛选的各菌均培养至10亿～100亿个/mL，按照选定的最优组合的发酵菌株比例及接种量加入35～37 ℃温水搅拌、活化20～30min，温水中含总发酵物料80～100 mg/mL红糖。菌株活化后，与银杏叶450～480 mg/mL、硫酸铵40～50 mg/mL，维生素C 1～2 mg/mL，硫酸钾1～2 mg/mL混合均匀，并补充水分至400～500 mg/mL，用装量1～2 kg呼吸膜包装、密封，常温（20～35 ℃）生料发酵10～15 d。发酵物料含水量、发酵温度及发酵时间是银杏叶发酵效果的重要因素，试验采用L934正交表进行优化试验。

1.2.5 银杏叶发酵效果的评价 在选定的最优工艺条件下发酵银杏叶，对其进行感官评定及营养分析，并与发酵前物料成分进行对比分析，分析银杏叶发酵后各指标的变化情况。

1.2.6 测定分析方法 pH值采用上海雷磁仪器厂生产的PHS-25型酸度计测定；乳酸含量采用南京建成乳酸检测试剂盒测定；纤维采用酸碱消煮法测定；黄酮采用芸香苷比色法测定；蛋白凯氏定氮法测定；总氨基含量采用 S433D 全自动氨基酸测定。各检测方法参照国家饲料检测分析标准进行[10]。

2 结果与分析

2.1 发酵菌株的筛选及鉴定

不同浓度银杏叶条件下，所接各菌的长势情况见表1，结果表明，不同类型的培养基中，银杏叶浓度越高，其对菌株的抑制作用越强。为了充分利用银杏叶中的营养成分，综合考虑选定银杏叶添加浓度40%～50%时，并从中筛选生长旺盛、长势良好、形态结构完整的菌落进行扩培、鉴定[11]，结果见表2，选定的菌株鉴定为地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌、产朊假丝酵母。

2.2 发酵菌株最适合菌株配比、接种量

发酵菌株最适合菌株配比、接种量的试验结果见表3。结果表明，地衣芽孢杆菌生长最为旺盛，生长快，当其比例多时，微生物总菌数也多。当微生物总菌数高时，各菌联合作用，银杏叶基质利用较多，所得蛋白含量、产生的乳酸含量也较高，为了便于提高工作效率，选定总菌数为筛选指标参考依据，按正交试验结果，选定的最优组合为A2B1C1D2，即地衣芽孢杆菌 ∶嗜热乳杆菌 ∶产朊假丝酵母=2 ∶1 ∶1，接种量5%，此条件下各菌生长旺盛，乳酸含量较多，粗蛋白和多肽含量也较高。

2.3 发酵工艺条件的优化

银杏叶发酵工艺条件的优化结果见表4、表5，结果表明，最佳的制备工艺条件为A3B3C2，即含水量50%、发酵时间 15 d、发酵温度30 ℃，其中发酵物料含水量对发酵过程影响最大，达到极显著水平。

2.4 银杏叶发酵效果评价

银杏叶发酵后与发酵前的营养成分进行对比分析，结果见表6。结果表明，发酵后复合菌株大量生长，嗜热乳杆菌产生了乳酸的香味，并且地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母将银杏叶中的纤维、黄酮分解，使其发酵物质中的粗蛋白、氨基酸含量显著上升，提高了产品的益生菌含量、适口性及营养成分。

3 结论与讨论

通过含不同浓度银杏叶的筛选培养基得到适合银杏叶发酵的微生物菌株，通过鉴定确认为地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌、产朊假丝酵母，并通过正交试验，优化得到了适合银杏叶发酵的最佳工艺条件为：地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌、产朊假丝酵母以2 ∶1 ∶1比例混合，接种量按总发酵物料5%接种，含水量50%、发酵时间15 d，发酵温度30 ℃，与发酵前物料相比，发酵后复合菌株大量生长，嗜热乳杆菌产生了乳酸的香味，并且地衣芽孢杆菌、产朊假丝酵母将银杏叶中的纤维、黄酮分解，使其发酵物质中的粗蛋白、氨基酸含量显著上升，提高了产品的益生菌含量、适口性及营养成分。

银杏叶发酵制剂的研制国内报道较少，本研究采用多菌联合发酵银杏叶是一个开创性的工作，各益生菌相互作用，对银杏叶中的基质能更好地利用，所得营养物质更为丰富，这对银杏叶制剂的推广应用具有更好的现实作用[12-13]。而对银杏叶发酵制剂产品的实际开发、使用对象、使用效果等有待于进一步研究阐明。

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