冬瓜皮中总三萜的提取工艺优化

陈月华，王　娜，李　嘉，李　瑞，李　真，范会平

（河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州　450002）



冬瓜皮中总三萜的提取工艺优化

陈月华，王娜，李嘉，李瑞，李真，*范会平

（河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002）

摘要：为了优化冬瓜皮中总三萜的最佳提取工艺条件，在单因素试验基础上，选取了料液比、乙醇体积分数和提取温度为影响因子。根据Box- Behnken中心组合原理设计三因素三水平试验，以冬瓜皮中总三萜的提取量为响应值进行响应曲面分析。结果表明，冬瓜皮中总三萜提取的最佳工艺条件为料液比1∶11（g∶mL），乙醇体积分数95%，提取温度80℃，且实际提取量为3 798.63 μg/g，与模型预测值（3 817.43 μg/g）基本相符。

关键词：冬瓜皮；总三萜；提取工艺

冬瓜为一年生草本植物，原产于中国南方各地及印度，现在东亚和南亚地区广泛栽培。冬瓜可以煮汤、炒食，具有减肥、润肺、消除身体水肿的功效。冬瓜皮是冬瓜的干燥外层果皮，分为表面有刺和表面没刺2种［1］。冬瓜皮营养丰富，含多种挥发性成分、三萜类化合物、胆固醇衍生物，以及烟酸、胡萝卜素、VB1和VC等矿物质和微量元素等。三萜类化合物具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物与抗生育等多种生物活性［2-3］。目前，对冬瓜皮中总三萜的提取工艺很少报道，本试验在单因素试验的基础上，采用响应面法优化冬瓜皮中总三萜的提取工艺条件，以期为冬瓜皮中总三萜的提取提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

冬瓜皮，采集于孟州市培茂食品厂。

1.2试验试剂

香草醛、高氯酸，天津市科密欧化学试剂有限公司提供；冰醋酸、无水乙醇、95%乙醇，均为分析纯；天津市永大化学试剂有限公司提供；齐墩果酸（含量94.9%），中国药品生物制品检定所提供。

1.3仪器与设备

L950型紫外-可见-近红外分光光度计，珀金埃尔默股份有限公司产品；XP6型微量电子天平，梅特勒托利多公司产品；HH- C型电热恒温水浴锅，天津市华北实验仪器有限公司产品；XH- C型漩涡混合器，江苏省金坛市医疗仪器厂产品；JT- C型匀浆仪，漯河市金田试验设备研究所产品。

1.4试验方法

1.4.1样品的预处理

将冬瓜皮干燥后打磨成粉，放入棕色瓶中密封保存。

1.4.2齐墩果酸标准曲线的绘制

准确称取齐墩果酸标准品10.0 mg甲醇溶解后转移到50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀即得齐墩果酸标准品母液，以此母液配成20 μg/mL齐墩果酸标准溶液（取1 mL齐墩果酸标准品母液于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度），精确吸取20 μg/mL的齐墩果酸标准溶液0，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mL分别置于6支10 mL的具塞试管中，75℃水浴中挥发尽甲醇溶剂，水浴蒸干后加入0.3 mL新鲜配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，于60℃恒温下反应20 min，冰水冷却，冰醋酸定容至10 mL，混匀后于550 nm波长下测定吸光度［4-5］。并以齐墩果酸质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线。

1.4.3试样含量的测定

总三萜含量测定采用香草醛比色法［6］。精确称取干燥的冬瓜皮粉末1.0 mg置于20 mL的具塞锥形瓶中，加入规定体积的乙醇，在规定温度和时间下进行提取。将提取液定容至50 mL容量瓶，精确吸取提取液1 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度（稀释提取液10倍），精确吸取样品提取液1 mL加入10 mL的具塞试管中，于75℃水浴中挥发尽甲醇溶剂，水浴蒸干，加0.3 mL新鲜配制的质量分数5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL的高氯酸，于60℃恒温下反应20 min，冰水冷却，冰醋酸定容至10 mL，混匀后于550 nm波长下测定吸光度。每个试样2个平行，从其齐墩果酸标准曲线计算所测总三萜含量，再根据下列公式计算出1.0 g冬瓜皮中总三萜的含量。

式中：X——冬瓜皮干物质总三萜量，μg/g；

C——冬瓜皮提取液总三萜质量浓度，μg/mL；

m——冬瓜皮粉末样品提取称样量，g；

x——冬瓜皮粉末样品的水分含量，%。

1.4.4单因素试验考察

考察不同提取次数、不同料液比、不同提取温度、不同提取时间、不同乙醇体积分数对冬瓜皮中总三萜类提取量的影响。

1.4.5响应面试验

综合单因素试验结果，根据Box- Behnken的中心组合设计原理，分别选取提取温度、料液比、提乙醇体积分数作为自变量，以冬瓜皮中总三萜的提取量作为响应函数，采用响应面分析法，通过回归得出自变量与响应函数之间的统计模型。

2　结果与分析

2.1齐墩果酸标准曲线

总三萜化合物标准曲线见图1。

图1　总三萜化合物标准曲线

由图1可知，标准曲线线性回归方程。结果表明，在齐墩果酸质量浓度为0～3 μg/mL线性关系良好。根据标准方程和公式，可得冬瓜皮中总三萜的含量。

2.2单因素试验

2.2.1提取次数对总三萜提取量的影响

以95%乙醇为提取溶剂，在70℃条件下提取2 h，提取1次，过滤后得提取液，沉淀后再提取第2次，再次过滤后得提取液。用香草醛比色法分别测定第1次和第2次提取液吸光度，分别计算第1次、第2次总三萜提取量。

提取次数对冬瓜皮总三萜化取量的影响见表1。

表1　提取次数对冬瓜皮总三萜提取量的影响

由表1可知，第1次提取量较大，提取量已达3 344.87 μg，第2次提取量仅620.45 μg。如果提取次数增加，不仅造成资源的浪费，也增加浓缩工序的难度，故选取提取次数为1次。

2.2.2料液比对总三萜提取量的影响

以95%乙醇为提取溶剂，在70℃条件下提取2 h，提取1次，分别用1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14的料液比提取，过滤后得提取液，香草醛比色法测吸光度，计算提取量。

料液比对冬瓜皮总三萜提取量的影响见表2。

表2　料液比对冬瓜皮总三萜提取量的影响

由表2可知，当料液比为1∶6时，提取量较低；当料液比为1∶8，1∶10，1∶12，1∶14时，提取量较高且相近，为节约成本，故选取料液比为1∶10。

2.2.3提取温度对总三萜提取量的影响

以95%乙醇为提取溶剂，料液比1∶10，提取时间2 h，提取1次，分别在25，40，55，70，85℃温度下提取，过滤后得提取液，香草醛比色法测吸光度，计算提取量。

提取温度对冬瓜皮总三萜提取量的影响见表3。

表3　提取温度对冬瓜皮总三萜提取量的影响

由表3可知，随着提取温度的不断升高，总三萜提取量亦随之增加，提取温度85℃时的总三萜提取量最高，但85℃为试验中最高温度，故选用提取温度为70℃。

2.2.4乙醇体积分数对总三萜提取量的影响

以提取温度70℃，料液比1∶10，提取时间2 h，提取1次，选择乙醇体积分数分别为55%，65%，75%，85%，95%进行提取，香草醛比色法测吸光度，计算提取量。

乙醇体积分数对冬瓜皮总三萜提取量的影响见表4。

表4　乙醇体积分数对冬瓜皮三萜化合物提取量的影响

由表4可知，随着乙醇体积分数的变大，总三萜提取量亦随之增加；乙醇体积分数为95%时，总三萜提取量最高，故选用乙醇体积分数为85%。

2.2.5提取时间对总三萜提取量的影响

以95%乙醇为提取溶剂，料液比1∶10，提取1次，在70℃条件下提取。提取时间分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，过滤后得提取液，香草醛比色法测吸光度，计算提取量。

提取时间对冬瓜皮总三萜提取量的影响见表5。

表5　提取时间对冬瓜皮总三萜提取量的影响

由表5可知，提取量随提取时间的延长而增大，但在1.0～3.0 h内增长，故确定提取时间为1 h不再优化。

2.3响应面试验

2.3.1模型的建立与显著性分析

根据中心组合设计原理，综合单因素试验考察结果，要得到更加精确的结果，需要进行更复杂的试验进一步优化。根据单因素试验结果，试验因素的水平范围，得进行响应曲面优化试验分析的优化试验因素的水平范围。

响应曲面优化试验的因素与水平设计见表6。

表6　响应曲面优化试验的因素与水平设计

冬瓜皮中总三萜提取工艺响应面试验安排见表7，总三萜提取量方差分析见表8，总三萜提取量方差分析结果见表9。

表7　冬瓜皮中总三萜提取工艺响应面试验安排

表8　总三萜提取量方差分析

试验数据采用响应曲面分析软件Design Expert 6.0.5 Trial进行多元回归分析，得到了预测响应值与编码自变量的二次多项回归模型方程［7-8］，见方程（1），其中A为提取温度、B为料液比、C为乙醇体积分数。

由表8可知，回归方程模型高度显著，决定系数（R- Squared）=0.920 5，说明响应值的变化有92.5%来源于所选自变量；失拟项=0.542 5＞0.05不显著，说明回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，可用该回归模型代替试验真实点对结果进行分析。

乙醇体积分数和料液比对总三萜提取量影响的等高线和响应面见图2，乙醇体积分数和提取温度对总三萜提取量影响的等高线和响应面见图3，料液比和提取温度比对总三萜提取量影响的等高线和响应面见图4。

表9　总三萜提取量方差分析结果

图2　乙醇体积分数和料液比对总三萜提取量影响的等高线和响应面

由图2可知，在提取温度一定的条件下，随乙醇体积分数的升高，响应值升高，至乙醇体积分数约95%时存在极大值；总三萜提取量也随液料比的增大而增大，料液比为1∶10.65时，响应值达最大；乙醇体积分数对响应值的影响最显著。由图3可知，在料液比一定的条件下，乙醇体积分数为95%，响应值随提取温度的增加而升高，在提取温度约为79.37℃处达最大值，而且总三萜提取量始终随乙醇体积分数的增高而增高。由图4可知，在乙醇体积分数一定的条件下，总三萜提取量响应值随提取温度的升高而升高，而料液比对响应值的影响不显著。

2.3.2验证试验

图3　体积分数和提取温度对总三萜提取量影响的等高线和响应面

图4　料液比和提取温度比对总三萜提取量影响的等高线和响应面

通过响应面分析得到冬瓜皮中总三萜提取的最优工艺条件为乙醇体积分数95%，提取温度79.37℃，料液比1∶10.65。在此条件下，冬瓜皮总三萜的预测提取量为3 817.43 μg/g。为了验证回归模型的有效性，根据推断的最佳工艺参数和实际操作过程中的可行性，以乙醇体积分数95%，提取温度80℃，料液比1∶10和1∶11的条件下进行验证试验。实际测得量分别为3 741.67，3 763.54，3 807.48，3 789.79 μg/g，测得平均值分别为3 752.6，3 798.63 μg/g。所以在料液比为1∶11测定结果稳定，偏差较小，数据重现性良好，与预测值更为接近。这充分反映该模型合理有效，能够为实际操作提供较好的指导。

3　结论

在单因素试验的基础上，应用响应面法优化总三萜的提取工艺条件。回归分析结果表明，提取温度和乙醇体积分数对总三萜提取量的影响更加显著。总三萜提取量用响应方程的回归分析和验证试验表明，该方法合理可行。冬瓜皮中总三萜提取最佳条件为乙醇体积分数95%，提取温度80℃，料液比1∶11（g∶mL）。

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Optimization of the Extraction of Total Triterpenoids from Wax Gourd Peel

CHEN Yuehua，WANG Na，LI Jia，LI Rui，LI Zhen，*FAN Huiping
（He'nan Agricultural University，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

Abstract：In order to optimize the extraction of triterpenoids from wax gourd peel，the experiment are arranged according to Box- Behnken central composite experiment design. Three independent factors of extraction，such as the ratio of liquid to solid，concentration of ethanol and extraction temperature，are considered on the basis of single factor experiments. The results show that the optimum extraction conditions for total triterpenoids are as follows the ratio of liquid to solid 1∶11（g∶mL），concentration of ethanol 95%，extracting temperature 80℃. The experiment value（3 798.63 μg）is in good agreement with its predicted value（3 817.43 μg）by model.

Key words：wax gourd peel；triterpenoids；extraction process

中图分类号：TQ461

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.05.010

文章编号：1671- 9646（2016）05a- 0032- 04

收稿日期：2016- 03- 28

基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费资助项目（201303079）。

作者简介：陈月华（1988—），女，硕士，研究方向为食品科学。

*通讯作者：范会平（1972—），女，博士，副教授，研究方向为农产品加工与贮藏、功能活性成分开发与应用。