木瓜蛋白酶酶解豆渣制备锌螯合盐

吴瑞蓝，林嘉怡，周燕芳，衷明华

（韩山师范学院，广东潮州　521041）



木瓜蛋白酶酶解豆渣制备锌螯合盐

吴瑞蓝，林嘉怡，*周燕芳，*衷明华

（韩山师范学院，广东潮州521041）

摘要：针对豆渣蛋白含量高、产量大而未被充分开发利用的特点，研究采用木瓜蛋白酶酶解豆渣以制备锌螯合盐，从而实现提高大豆加工副产物豆渣资源的附加值。以豆渣为原料，通过单因素试验和正交试验，优化木瓜蛋白酶的酶解工艺条件，并研究豆渣酶解物与锌螯合制备多肽螯合盐的工艺。结果表明，木瓜蛋白酶最佳酶解条件为酶解温度50℃，酶解时间6 h，酶添加量0.04 g，豆渣添加量5 g，并以硫酸锌为锌源，得到的螯合率和螯合物中的锌含量分别为53.78%和40.00%。

关键词：豆渣；木瓜蛋白酶；锌螯合盐

衷明华（1957—），男，硕士，教授，研究方向为分析化学。

0　引言

大豆在我国乃至世界都是最重要的植物之一，从大豆及其衍生产品中开发新一代补锌产品，原料来源容易、成本低、消费者易接受，可满足大规模生产［1-2］。豆渣是生产豆奶或豆腐过程中的副产品，每年我国豆渣的产量都很大，因其具有较高蛋白质含量的特点，被当作饲料，用于制作糕点食品、健康食品以及化妆品和抗菌素原料。豆渣酶解液含有丰富的氨基酸、小肽、微量元素等多种小分子营养成分，具有生物利用率高等优点［3-4］。其中，锌是人体必需微量元素，参与体内200多种金富酶的组成，是细胞内最丰富的微量元素。因此，加强对豆渣的利用研究有着重要的意义。

越来越多的研究表明，多肽锌螯合盐的吸收转运机制能够按照多肽的转运机制进行，而非人体肠道中无机锌盐的吸收体制，因此氨基酸或肽的锌螯合盐具有更好的吸收率，生物利用率也较高。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

豆渣，市售；木瓜蛋白酶（10×104U/g，固体粉末）、考马斯亮蓝、牛血清蛋白、无水硫酸锌（ZnSO4）、95%乙醇、EDTA、柠檬酸钠缓冲剂（pH值5）、NH3-NH4Cl缓冲液（pH值10）、络黑T、三乙醇胺、无水乙醇、无水硫酸镁（MgSO4），均为分析纯。

1.2仪器与设备

2K072型电热真空干燥箱，上海市实验仪器总厂产品；HH-2型数显恒温水浴锅，常州国华电器公司产品；SDH-III型循环水式多用真空泵，上海丞明仪器设备有限公司产品；KA-1000型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；722SP型分光光度计，上海棱光技术有限公司产品。

1.3试验方法

1.3.1豆渣粗蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法［5］。

1.3.2酶解液中多肽含量的测定

采用考马斯亮蓝法［6］。

1.3.3检测方法

（1）锌含量的测定采用EDTA络合滴定法［3］。按式（1）计算螯合物中锌含量：

（2）螯合率的测定。移取10 mL待测液，加入95%乙醇沉淀（乙醇含量达到90%以上），静置，过滤；将滤液再次浓缩后进行乙醇沉淀（乙醇含量达到95%以上），静置，过滤。取滤液测定游离锌含量，按式（2）计算螯合率。

1.3.4豆渣酶解液的制备工艺流程

豆渣→加入适量木瓜蛋白酶→酶解→抽滤→离心→取上清液→测定多肽转化率。

1.3.5单因素试验

木瓜蛋白酶酶解豆渣时，影响酶解反应的主要因素有酶解温度、酶解时间、酶添加量、豆渣添加量等。因此，试验以酶解温度、酶解时间、酶添加量、豆渣添加量为考察因素。

（1）最佳酶解温度的确定。设定酶添加量0.03 g，酶解时间3 h，豆渣添加量2 g，选择酶解温度30，40，50，60，70℃，以多肽转化率为指标确定最佳酶解温度。

（2）最佳酶解时间的确定。设定酶添加量0.03 g，豆渣添加量2 g，酶解温度60℃，选择酶解时间为2，3，4，5，6 h，以多肽转化率为指标确定最佳酶解时间。

（3）最佳酶添加量的确定。设定酶解时间为3 h，豆渣添加量为2 g，酶解温度为60℃，选择酶添加量为0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 g，以多肽转化率为指标确定最佳酶添加量。

（4）最佳豆渣添加量的确定。设定酶添加量为0.03 g，酶解时间为3 h，酶解温度为60℃，选择豆渣添加量为1，2，3，4，5 g，以多肽转化率为指标确定最佳豆渣添加量。

1.3.6五因素四水平正交试验设计优化酶解工艺条件

在单因素试验的基础上，以多肽转化率为指标，采用五因素四水平正交试验设计，试验采用L16（45）正交表。

试验的因素与水平设计见表1。

1.3.7豆渣多肽锌螯合盐的合成工艺

表1　试验的因素与水平设计

酶解液→调整合适的螯合条件（pH值5.0、螯合温度60℃、螯合时间40 min）→加入适量硫酸锌（肽锌质量比2.25∶1）→乙醇沉淀（乙醇含量达到90%以上，静置）→过滤→干燥。

2结果与分析

2.1单因素试验

豆渣的粗蛋白含量为38.76%，按式（3）计算多肽转化率：

2.1.1酶添加量对豆渣酶解液中多肽含量的影响酶添加量对豆渣多肽转化率的影响见图1。

图1　酶添加量对豆渣多肽转化率的影响

在豆渣添加量为2 g的条件下，加入不同量的木瓜蛋白酶，在60℃恒温酶解3 h，测定多肽转化率。由图1可知，酶添加量为0.03 g的多肽含量最高。

2.1.2豆渣添加量对豆渣酶解液中多肽含量的影响

豆渣添加量对豆渣的多肽转化率的影响见图2。

图2　豆渣添加量对豆渣多肽转化率的影响

在酶添加量为0.03 g的条件下，加入不同量的豆渣，在60℃恒温酶解3 h，测定多肽转化率。由图2可知，豆渣添加量为5 g的多肽含量最高。

2.1.3酶解温度对豆渣酶解液中多肽含量的影响

酶解温度对豆渣多肽转化率的影响见图3。

图3　酶解温度对豆渣多肽转化率的影响

木瓜蛋白酶的有效温度范围是20～80℃，由图3可知，作用于豆渣蛋白的最佳酶解温度是60℃。

2.1.4酶解时间对豆渣酶解液中多肽含量的影响

酶解时间对豆渣多肽转化率的影响见图4。

图4　酶解时间对豆渣多肽转化率的影响

在酶添加量为0.03 g，豆渣为2 g的条件下，在60℃恒温酶解，测定不同酶解时间的多肽转化率。由图4可知，酶解时间为3 h的多肽含量最高。

2.2五因素四水平正交试验的结果与分析

采用五因素四水平正交试验设计对豆渣蛋白的酶解工艺条件进行优化，将试验数据按L16（45）正交表填入。控制酶解的效果以多肽转化率为分析指标。

2.2.1结果分析

试验结果与分析见表2。

由表2可知，以试验为15的多肽转化率最高，其水平组合为A4，B3，C2，D4，分别是各因素影响最大的水平。本试验各因素的最优组合为A2，B4，C2，D4，对2个组合转化率比较后得出最优组合高于最大水平组合。而通过极差R值的大小可以看出本试验因素存在显著性顺序，其主次关系为C＞A＞D＞B，即影响豆渣酶解反应的最主要因素是酶解温度，其次是酶添加量、酶解时间、豆渣添加量。

2.2.2结果与讨论

通过利用正交试验设计得出用木瓜蛋白酶酶解豆渣时，对试验影响最大的因素是酶解温度。豆渣蛋白的最佳酶解条件为酶解温度50℃，酶添加量0.04 g，酶解时间6 h，豆渣添加量5 g。

2.3螯合率及螯合物中锌含量的测定结果

在肽锌质量比为2.25∶1，pH值5.0的条件下，移取20 mL的酶解液，在60℃恒温螯合40 min，得到的螯合率和螯合物中的锌含量分别为53.78%和40.00%。

表2　试验结果与分析

3　结论

本试验选用豆渣进行酶解得到多肽液，并与锌进行螯合，得到新一代的补锌产品多肽锌螯合盐。通过单因素试验和五因素四水平正交优化试验，得到木瓜蛋白酶酶解豆渣的最佳酶解条件为酶解温度50℃，酶添加量0.04 g，酶解时间6 h，豆渣添加量5 g。在螯合温度为60℃，pH值为5.0，螯合时间为40 min，肽锌比为2.25∶1的条件下，测得的螯合率为53.78%，螯合物中锌含量为40.00%。

参考文献：

［1］杨珊珊.罗非鱼皮多肽锌螯合盐的制备及性质研究［D］.南昌：南昌大学，2008.

［2］赵洪雷.鲢鱼蛋白小肽锌螯合盐的制备及其生物活性研究［D］.武汉：华中农业大学，2009.

［3］牛翠英，沈敏，肖珊.钙锌盐中锌含量的测定-EDTA络合滴定法［J］.中国井矿盐，2010，41（3）：30-32.

［4］彭燕，关志强，张钟，等.罗非鱼下脚料蛋白深度水解的工艺优化［J］.广东农业科学，2011（6）：116-119.

［5］陆卫明，尹华.用蛋白质测定仪测定食品中的蛋白质［J］.江苏预防医学，2007，18（1）：61-62.

［6］邓丽莉，潘晓倩，生吉萍，等.考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量的条件优化［J］.食品科学，2012（24）：185-189.

Enzymatic Hydrolysis of Soybean Dregs by Papain to Prepare Zinc Chelate Salt

WU Ruilan，LIN Jiayi，*ZHOU Yanfang，*ZHONG Minghua
（Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong 521041，China）

Abstract：Bean dregs protein content is high，large output without being fully exploited the characteristics of study papain bean dregs to prepare a zinc chelate salt，in order to achieve increase the added value of soybean byproducts bean dregs resources.The bean dregs as the raw material，through a single factor test and orthogonal test conditions papain enzyme and research bean dregs hydrolysates and polypeptides chelated zinc chelate salt preparation of process.The results show that papain optimum conditions for hydrolysis temperature 50℃，time 6 h，enzyme dosage 0.04 g，bean dregs quality 5 g，zinc sulfate and zinc source，chelating rate and chelate zinc content are obtained 53.78%and 40.00%.

Key words：bean dregs；papain；zinc chelate salt

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.05.033

文章编号：1671-9646（2016）05b-0016-03

收稿日期：2016-03-31

作者简介：吴瑞蓝（1994—），女，本科，研究方向为农产品加工与开发。

*通讯作者：周燕芳（1979—），女，本科，高级实验师，研究方向为农产品加工与开发；