受精液种类、卵丘细胞及卵巢保存温度对奶牛体外受精效果的影响

林+峰++黄承俊++宋+欢++孙守强++王幸栓++李+峰++梁景山++胡艳芳++侯发全++刘海军

摘 要：为了提高奶牛体外受精效果，研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO和TALP三种体外受精液中的受精效果，同时比较了裸卵（NOs）与卵丘卵母细胞复合体（COCs）对受精效果的影响，卵巢的不同保存温度对卵母细胞受精效果的影响。结果显示，体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液的（P<0.05），而TALP液中的卵裂率与IVF-100和BO液的差异都不显著（P>0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著（P>0.05）；NOs的囊胚率极显著低于COCs的（P<0.01）；卵巢在10和37 ℃下保存2～3 h，卵母细胞卵裂率和囊胚率差异均不显著（P>0.05）。

关键词：奶牛；卵母细胞；卵裂率；囊胚率

中图分类号：S858.23 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.007

Agricultural University ， Zhengzhou， Henan 450002 ， China； 3. No. 11 Farm， Tianjin Jialihe Husbandry Corporation， Tianjin 300273 ， China； 4.Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University， Shanghai 201508， China； 5.Xiaying Animal Sciences and Veterinary Medicine Station of Jixian County， Tianjin 300193， China； 6.Animal Health Supervision and Inspection Institute of Jixian County， Tianjin 301900， China）

Abstract： In order to improve the effect of fertilization in vitro of cows， this study compared the effect of fertilization among the IVF-100， BO and TALP solution. Meanwhile， this test compared the effect of fertilization between NOs and COCs，and the trail explored the difference of effect of fertilization on different temperature for ovaries. The results showed that the rate of cleavages of the oocytes in IVF-100 was significantly higher than that in BO （P<0.05），while the oocytes rate of cleavages of TALP solution had no significant differences with that in IVF-100 and BO （P>0.05）.The rate of cleavages of NOs was lower than that of COCs， while there was no significant difference （P>0.05），but the NOs rate of blastocyst was extreme significantly lower than that of COCs （P<0.01）. Also， there was no significant difference between the rate of cleavages and the rate of blastocyst when the ovaries stored in 10 and 37 ℃ for 2～3 hours （P>0.05）.

Key words： cows； oocytes； cleavage rate； blastocyst rate

随着配子与胚胎生物技术的研究与应用，对胚胎的需求量越来越大。超数排卵和胚胎移植的合理化应用虽能成倍提高优良母畜的繁殖率，但所获得的胚胎数量有限。为了解决这个问题，近年来国内外对奶牛卵母细胞体外受精技术进行了大量的研究。保国俊、Ginther等[1-2]通过IVF技术可提供数量更多、成本更低的胚胎，体外受精技术是对优良公、母畜的综合充分利用。近年来，牛体外受精技术 （In vitro fertilifation， IVF）取得了较大进展，已成为可在实验室条件下生产大量廉价胚胎的实用技术，将为胚胎移植提供重要的胚胎来源。牛体外受精技术一直是研究的热点。但由于体外受精技术操作环节复杂，操作过程涉及因素较多以及卵母细胞对体外生存环境要求较高，使得试验体系不稳定，进而影响试验结果的准确性[3]。

本试验通过对比不同受精液对卵母细胞体外受精效果影响的研究，分析了不同形态的卵子和卵巢运输保存温度对奶牛成熟卵母细胞体外受精能力的影响，皆在为优化奶牛体外受精技术奠定基础。

1 材料和方法

试验中所用的化学试剂除特别说明外，均购自Sigma公司。

1.1 卵巢的采集与保存

奶牛卵巢采集自河北省大厂个体屠宰场。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪组织，然后用加有双抗的生理盐水冲洗5～6次，保存在盛有10或37 ℃、加有双抗的灭菌生理盐水中，于2～3 h内带回实验室。

1.2 卵母细胞的采集

用无菌纱布将卵巢表面擦干，抽吸法吸取直径2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培养皿中，根据试验不同的需求挑选裸卵及具有一层以上完整卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus oocyte complexes，COCs）用于试验。

采卵液：TCM-199（Gibco）+5%胎牛血清（FBS，Gibco）+30 g·mL-1肝素钠+4.766 g·L-1 Hepes。

1.3 体外成熟培养

将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40～60个移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5 ℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23～24 h，以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志。

成熟液：TCM-199+10%FBS+10 g·mL-1 FSH（宁波三生）+20 g·mL-1 LH（宁波三生）+1 g·mL-1 E2。

1.4 体外受精

受精液为IVF-100（Research Institute for the Functional Peptides， Yamagata， Japan）或BO液时运用直接离心法对精子进行洗涤，即用6 mL洗精液稀释解冻的精液并于2 000 r·min-1下离心7 min，弃去上清液，重复1次后用受精液稀释精子，密度为1×106～6×106 个·mL-1，然后放入CO2培养箱中备用。受精液为TALP液时则用上浮法对精子进行30～60 min的孵化，然后再离心洗涤。将23～24 h成熟的卵母细胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管将卵丘细胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蜡油的50 L受精微滴中，加入50 L精液后于CO2培养箱中进行受精。IVF-100受精时间为6 h，BO液受精时间为8 h，TALP液受精时间为18 h.

1.5 胚胎的体外培养

胚胎培养液为CR1aa。将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用1 mL移液管部分或全部去除周围的卵丘细胞。以10枚假定受精卵/100 L微滴的方法，将假定受精卵随机平等地移入平衡至少2 h的微滴中进行体外培养。从体外受精开始算起，第48小时对各组卵裂率进行观察与记录，第7～9天对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液。

1.6 统计分析

采用SPSS 11.0统计软件进行数据的整理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同受精液对卵裂的影响

将经体外成熟的卵母细胞随机平等地移入3种不同的受精微滴中进行受精，即TVF-100、BO液和TALP液。受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起第48 小时对各组的卵裂情况进行统计分析。从表1可以看出，用IVF-100作为受精液，其体外受精48 h后的卵裂率显著高于BO液的（P<0.05）卵裂率，而以TALP液作为受精液其卵裂率与其他组并无差异。说明不同的受精液对卵裂有显著的影响，从卵母细胞卵裂率来看，IVF-100作为受精液显著优于BO液和TALP2种受精液。

2.2 有无卵丘细胞对卵母细胞受精及受精后体外发育的影响

选取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母细胞（COCs）进行体外受精，用IVF-100受精液稀释精子，受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起第48 小时对各组的卵裂情况进行统计分析。从表2可以看出，虽然自然裸卵卵裂率低于COCs，但结果检验并不显著，而其囊胚率显著低于COCs的。这表明，卵丘细胞对卵母细胞受精后体外发育的影响要远高于对卵母细胞受精的影响。

2.3 卵巢的不同保存温度对卵母细胞体外受精的影响

卵巢采集后，分别将卵巢放入10和37 ℃的加有双抗的灭菌生理盐水中2～3 h运回实验室，抽取卵泡中的卵母细胞进行体外成熟培养，用IVF-100受精液稀释精子，受精后进行胚胎的体外培养，从受精开始算起第48 小时对各组的卵裂情况进行统计分析。从表3可以看出，在10和37 ℃条件下保存卵巢其卵裂率和囊胚率均无显著差异。

3 讨 论

3.1 不同受精液对奶牛卵母细胞体外受精的影响

试验结果显示，IVF-100作为受精液时的卵裂率显著高于BO液的，虽然在数值上表现出高于TALP液的趋势，但统计检验无差异。同时，TALP液与BO液的卵裂率也无明显差异，结果表明不同受精液对试验结果有着较大的影响。

IVF-100为商品化的受精液，基础液为BO液，其效果稳定而且效率较高，对于成熟良好的卵母细胞，受精率一般高达80%～90%。由于其价格较高，常用于活体取得的卵子体外受精上或其他精密试验中。笔者的试验结果显示，IVF-100的卵裂率明显高于BO液的，这在许多实验中均得到了证实。一般情况下，BO液的受精率在40%～70%，但有时也能够在一些单独的实验中看到BO液的高效卵裂结果。这表明，IVF-100在促进受精卵的卵裂上要强于BO液，同时，也说明BO液作为体外受精液还存在巨大的改进空间。BO液对精子的作用比较强烈，因而与精卵共孵化的时间不能过长。相比之下，TALP液对精子的作用就比较温和些，与本试验结果相同，许多实验显示其虽然在数值上有高于BO液的趋势但统计结果无差异[4]。而且，一些实验结果表明其稍后的胚胎发育效果要低于BO液的[5]，由于这方面受受精时间、卵丘细胞、精子的洗涤等许多因素的制约，其机制仍有待探索。也有人对TALP液与IVF-100的卵裂效果进行了比较，其结果有与本试验相同的，也有不同的。就总体而言，成熟良好的卵母细胞不管用什么受精液其受精卵的卵裂率都较高，但IVF-100对受精卵卵裂的促进作用要强于其他受精液。IVP技术作为一个整体其各个环节精密相关，因而要想得到较多的可移植胚，一个相对较好的受精环节是必须的。

3.2 有无卵丘细胞对卵母细胞体外受精效果的影响

自然裸卵与COCs经体外成熟后，对其体外受精的卵裂率及囊胚发育率进行比较，结果显示自然裸卵的卵裂率显著低于COCs的，并且囊胚发育率达到了极显著水平。但笔者的试验结果表明自然裸卵是能够发育到囊胚的，这与许多实验结果相违背[6]。笔者的结果并不排除个别特殊卵母细胞的存在，但其原因仍有待进一步探索。研究表明，卵母细胞成熟过程中的许多机制都需要通过卵丘细胞来完成，自然裸卵经体外成熟培养后虽然能够部分排出第一极体，但没有继续发育的潜力[7]，受精后并不能发育到囊胚阶段。有人对卵丘细胞旁分泌进行分析，发现目前已经确认的卵丘细胞分泌物主要有类固醇、透明质酸和还原型谷胱甘肽，而这些物质主要对受精和胚胎发育过程具有重要的促进作用[8-9]。笔者以前的研究表明，添加离散卵丘细胞能够促进机械裸卵的体外成熟[10]。

3.3 卵巢的不同保存温度对卵母细胞体外受精的影响

目前，奶牛卵巢卵母细胞的体外成熟和体外受精仍有许多问题需要解决，其中一个重要问题就是卵巢从屠宰场运回到实验室这段时间内，采用何种运输温度更有利于卵母细胞的发育。如果卵巢保存的好，卵泡内的卵母细胞就会有较强的生命力和活性，从而有利于体外成熟和体外受精。

到目前为止，大多数试验仍采用接近于生理温度（36±2） ℃为运输温度[11-12]。 本试验的结果表明，在10和37 ℃的生理盐水下保存牛卵巢，对卵母细胞的体外受精并没有显著影响。大量的研究结果表明，卵巢不同保存温度对奶牛卵母细胞的体外受精有很大影响，First等[13] 报道，当卵巢的贮存温度低于30 ℃时，会对卵母细胞的成熟和随后的胚胎发育产生不利的影响。邢凤英等[14]也报道，分别在22.0，30.0，37.0，38.5，40.0 ℃下保存卵巢，随着温度的升高，其卵母细胞体外成熟后的质量、激活后的卵裂率和囊胚率均明显下降。当达到40.0 ℃时，成熟培养后卵子的死亡率明显增加，激活后卵裂的形态异常率明显增加，细胞质不均匀，碎裂率升高，不能发育到囊胚，认为37 ℃的生理盐水保存猪卵巢效果最佳。但本研究表明，奶牛卵巢在10和37 ℃放置2～3 h其卵裂率和囊胚率不受明显影响。从常理上讲，应该是保存温度降低得越少越好，但有时结果并不是这样，其原因可能是奶牛接近排卵时卵泡内温度低于卵巢基质温度[15]。采用与奶牛卵母细胞体外成熟温度一样温度的生理盐水收集卵巢，对其卵巢内卵泡卵母细胞有不良影响。当采用和体外培养相同或更高温度的生理盐水保存卵巢时，卵子受到热应激[14]而影响其成熟后的质量。因此，在实际生产中，不用刻意地控制卵巢的保存温度。

4 结 论

（1）体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的受精效果卵裂率优于BO液与TALP液。

（2）裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母细胞复合体（COCs），但差异不显著；NOs能够发育到囊胚阶段，但囊胚率极显著低于COCs的。

（3）卵巢在10和37 ℃温度下保存2～3 h，卵裂率和囊胚率差异不显著。

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