复方健耳剂对C57BL/6J小鼠AHL毛细胞的保护作用

宣伟军丁大连，　蒋海燕杨琨韦瑀龙陈壮唐俊波广西中医药大学第一临床医学院耳鼻咽喉头颈外科2广西中医药大学瑞康医学院耳鼻咽喉头颈外科 Center for hearing deafness，the State University of New York at Buffalo，USA广西中医药大学瑞康医学院制药厂



复方健耳剂对C57BL/6J小鼠AHL毛细胞的保护作用

宣伟军1，2丁大连1，2，3蒋海燕3杨琨3韦瑀龙4陈壮4唐俊波1
1广西中医药大学第一临床医学院耳鼻咽喉头颈外科
2广西中医药大学瑞康医学院耳鼻咽喉头颈外科
3 Center for hearing deafness，the State University of New York at Buffalo，USA
4广西中医药大学瑞康医学院制药厂

【摘要】目的探讨老年性耳蜗毛细胞损害与中药复方健耳剂两种喂药方法干预的作用。方法选择1月龄C57BL/ 6J小鼠22只用于本实验，其中4只小鼠每日饮用自来水直到出生后3个月作为幼龄对照组；6只小鼠每日饮用自来水直到出生后7个月作为老年性聋对照组；6只小鼠每日自动饮用中药复方健耳剂直到出生后7个月；另6只小鼠每日自动饮用同样中药至4个月后改用每日人工灌服直到出生后7个月。各组动物实验到期终止后，取耳蜗进行全耳蜗基底膜铺片，将全耳蜗内、外毛细胞计数结果输入计算机并应用耳蜗图软件进行耳蜗毛细胞密度对比分析，其中选择基底膜上重要的病变区间的毛细胞密度进行统计学分析。结果3月龄对照组小鼠耳蜗外、内毛细胞缺损仅仅出现在耳蜗底回钩端区域；7月龄对照组外、内毛细胞缺损从底回基底膜起始端扩展到距离耳蜗顶端约40％区域；7月龄中药灌服组和自动饮用组动物的内、外毛细胞缺损范围和程度相似，均显著比7月龄对照组为轻（P＜0.001）。结论中药复方健耳剂能够有效延缓C57BL/6J小鼠老年性耳蜗毛细胞损害的发生和发展，两种喂药方式所起作用相同（P＞0.05），其药理机制可能与其改善微循环，清除活性氧，保护线粒体等作用相关。

【关键词】C57BL/6J小鼠，老年性聋，毛细胞，中药

Funding:this research was supported by National Natural Science Foundation of China grant No.81260552，No.81373700，and Guangxi Natural Science Foundation of China grant No.2014GXNSFAA118162.

Competing interests:The authors have declared that no competing interests exist.

老年性聋又称年龄相关性聋（age-related hearing loss，AHL），随着社会人口老龄化加重，AHL发病率呈逐年大量增加趋势，据世界卫生组织（WHO）估计，到2025全世界60岁以上人口约有12亿，其中仅65-75岁老年人群中约70-80％将患有AHL，已成为严重影响老年人生活质量的常见和难治、甚至不治的感音神经性聋［1］，因此，寻找有效药物，对AHL早期发现，早期干预，早期防治的意义十分重大。复方健耳剂系笔者通过长期临床治疗感音神经性聋实践，不断总结和优化形成的中药新配方，为了了解其干预老年性耳蜗毛细胞损害影响作用，近年来我们以C57BL/6J小鼠作为AHL模型，观察了复方健耳剂对老年性聋发病早期小鼠的耳蜗毛细胞的保护作用，发现复方健耳剂具有显著延缓老年性耳蜗毛细胞损害的防治作用，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

选择1月龄刚断奶国产健康C57BL/6J小鼠22只，由北京维通利华实验动物技术公司提供［批号：SCXK（京）2012-0001］，雌雄不拘，随机分为3月龄幼龄对照组4只、7月龄对照组6只，同时针对学术界有学者提出实验动物自然饮用药物与人工灌喂药物可能产生不同结果的争议，因此专门设立了自然饮用药物和人工灌喂药物两组实验，即7月龄中药1组和中药2组各6只。3月龄对照组小鼠自断奶后食用常规饲料并饮用自来水至出生后三个月终止实验。7月龄对照组小鼠自断奶后食用常规饲料并饮用自来水至出生后七个月终止实验。7月龄中药1组小鼠自断奶后食用相同的常规饲料，但在出生后一个月开始每日自动饮用中药溶液以代替日常饮水，直到出生后七个月终止实验。7月龄中药2组小鼠前三个月饮药条件与7月龄中药1组完全相同，但到第四个月即开始改为每日人工灌服中药溶液直到出生后七个月止，这是因为3月龄以下小鼠尚处幼年阶段，难于承受和完成长达数月的每日人工灌喂药物，稍有操作不慎则极易造成局部损伤而导致动物死亡。所有期满实验小鼠的一侧耳用于全耳蜗毛细胞铺片和定位定量分析，另一侧耳的耳蜗膜迷路被用于其它研究与听功能检测结果将另文发表。

2　实验药物及用量

复方健耳剂主要由葛根、丹参、黄芪、骨碎补等组成。经过水煮、浓缩、烘干、反复粉碎和过筛等流程，制成每克药粉相当于6.63克生药材。按照《中药药理研究方法学》［2］小鼠与成人用量换算法，计算出该药的小鼠用量定为1.83g/kg/日。中药粉加适量比例水配兑（一般为0.05克药粉加5毫升水），盛于动物自吸喂养瓶内供小鼠自动饮用，在没有其它水源供应的实验条件下，实验动物因生理需要而必须每天摄取足够的饮水，因而也就保证了实验小鼠每天都能摄取到规定的药物剂量。其中中药2组到4月龄后改用人工灌服中药溶液至期满。

3　耳蜗毛细胞形态学观察

3.1耳蜗标本制备与铺片

将麻醉小鼠断头，然后在解剖显微镜下取出听泡，在蜗尖钻孔并摘除镫骨同时打开园窗，将10％福尔马林磷酸盐缓冲液从蜗尖孔灌入耳蜗，然后浸入上述固定液固定24小时以上。将取出的颞骨浸入5％盐酸溶液脱钙48小时，在解剖显微镜下分离取出全耳蜗基底膜，用苏木素染液常规对基底膜染色［3-5］。也可选择在固定前向耳蜗内灌入琥珀酸脱氢酶染色液，即由0.2M琥珀酸钠、0.2M磷酸盐缓冲液、0.1％氯化硝基四氮唑蓝按1：1：2配制而成，在37℃恒温箱内作用40分钟到60分钟，然后将耳蜗浸入10％中性福尔马林固定液固定24小时，常规脱钙后分离取出全耳蜗基底膜［3-5］。这两种常用染色方法并不存在造成细胞膨胀或者细胞缩小的问题，均可一致相同反映细胞的完整形态，或细胞损害，或消失，因此并不影响定位定量实验结果，均可用于定量评估耳蜗毛细胞的损害情况分析。最后将全耳蜗基底膜移入载玻片上的甘油滴中，使基底膜的网状膜面向上，盖上盖玻片，中性树胶封固［3-5］。

3.2耳蜗图和毛细胞的定位定量分析

从各组实验动物取出每只动物的一侧耳用于耳蜗铺片和耳蜗图制备。在光学显微镜下，分别对3月龄对照组，7月龄对照组和7月龄中药1组及7月龄中药2组观察全耳蜗基底膜上毛细胞的缺损情况。在置有标记单位长度为0.24mm的显微测量尺目镜的光学显微镜下，从蜗尖向蜗底逐个视野依次进行内、外毛细胞计数并将采集的数据输入到计算机中，数据经耳蜗图软件对C57小鼠耳蜗数据进行比较，耳蜗基底膜的实际全长被转换为百分比长度单位，单位长度内的毛细胞实际数量被转换成细胞密度并按照百分比分布在耳蜗基底膜的各个部位，从而建立该耳蜗的曲线分析图［3-5］。由于老年性耳蜗毛细胞缺损的范围是从耳蜗底回开始发生并逐渐向耳蜗顶回扩展，因此未发生毛细胞缺损的耳蜗顶回范围内的毛细胞计数结果将不适合用于分析毛细胞缺损程度的统计学比较。为此，我们分别将距离耳蜗顶回40％-70％和80％-90％两个区域的毛细胞密度值摘出，所有采集数据被输入到GraphPad prism5软件系统，应用X2检验进行统计学分析和比较，P＜0.05被确定为具有统计学意义的显著性差异。

3　结果

取自耳蜗基底部四组动物耳蜗铺片举例对照如图1A-D所示，3月龄对照组动物的三排外毛细胞和一排内毛细胞基本完好无损；7月龄对照组动物的三排外毛细胞和内毛细胞在同一部位却几乎损失殆尽；7月龄中药1组与中药2组动物的三排外毛细胞损失范围较小，两组间几乎不存在明显差别。耳蜗图结果显示3月龄对照组小鼠除Hook区域即距离蜗尖95-100％的位置出现毛细胞缺损之外，其余部位基本无毛细胞缺损（图2A）；7月龄对照组小鼠耳蜗从距离耳蜗顶回75-100％区间的外毛细胞全部缺损（图2A），内毛细胞的损失程度也越过50％区域（图2B），说明正常C57BL/6J小鼠在出生后7个月，毛细胞的缺损已经从耳蜗底回起始端蔓延到占基底膜全长50％的范围，尤其在距离耳蜗顶回80％到100％区间，所有内外毛细胞几乎全部缺损，这个结果与早期的实验研究结果完全相符［6，7］。值得注意的是，无论是自然饮用中药的7月龄中药1组还是从出生后4个月改为每天灌喂中药的7月龄中药2组，耳蜗内、外毛细胞的缺损程度都明显比同龄对照组小鼠减轻，即使在距离耳蜗顶回75％的区间，存活外毛细胞的数量也超过60％（图2A），而内毛细胞的损失数量很少（图2B）。从各组动物的平均耳蜗图截取点比较进一步分析不难看出，7月龄对照组动物的外毛细胞缺损已经从耳蜗底回蔓延到距离耳蜗顶回40％的区间，其中在60％区间的外毛细胞缺损范围达到40％，在80％区间则高达100％。然而，7月龄中药1组动物的外毛细胞损失虽然也蔓延到距离耳蜗顶回50％的区间，但在60％区间的外毛细胞缺损仅20％，在80％区间的外毛细胞缺损仅40％，而内毛细胞在上述两个区间却未发生缺损；与此相同的是，7月龄中药2组动物在距离耳蜗顶回60％区间并未发生毛细胞缺损率，在距离顶回80％区间的外毛细胞缺损为40％，而此区间的内毛细胞却几乎没有缺损。上述耳蜗铺片及耳蜗图结果均表明，7月龄中药1组或中药2组的内、外毛细胞缺损程度比7月龄对照组明显减轻，内、外毛细胞的缺损范围也明显比7月龄对照组缩小，说明无论是自然饮用中药还是灌喂中药，都能有效保护发生在C57BL/6J小鼠的老年性耳蜗损害。截取距离耳蜗顶回45％区间和75％区间的毛细胞损失经X2检验结果见表1，从统计学分析表可以看出，7月龄中药1组和7月龄中药2组与7月龄对照组相比，无论是外毛细胞还是内毛细胞的缺损程度，都具有极显著差异（P＜0.01），说明无论是自然饮用还是灌喂中药，复方健耳剂都能有效延迟老年性耳蜗毛细胞损害的发生和发展，两种用药方法无显著性差异（P＞0.05）。

图1　四组动物耳蜗铺片基底部对照：A 3月龄对照组三排外毛细胞和内毛细胞损失极轻，甚至基本完好无损。B 7月龄对照组三排外毛细胞和部分内毛细胞损失严重，甚至几乎殆尽。C、D分别为7月龄中药1组与中药2组，均显示三排外毛细胞和内毛细胞损失范围较小，两组间几乎没有什么差别。Fig.1 Comparisons of cochlear surface preparations at basal turn from 4 groups of animals.Ais typical example of cochlear at basal turn at 3 months of age with drinking tap water，which displayed that three rows of outer hair cells and inner hair cells were almost intact or their damages were extremely slight.B is typical example of cochlear surface preparation at basal turn at 7 months of age with drinking tap water，which displayed that damages in three rows of outer hair cells and part inner hair cells were extremely serious or they almost disappear.C and D respectively are typical examples of cochlear surface preparation at basal turn of group 1 with voluntarily and automatically drinking TCM and group 2 with feeding TCM at 7 months of age，which displayed that three rows of outer hair cells and inner hair cells were less damage，and there was no significant difference in comparison betweenthe group 1of TCMandthe group2of TCM.

图2　A，B分别为3月龄对照组、7月龄对照组、7月龄中药1组、7月龄中药2组外毛细胞和内毛细胞缺损的平均耳蜗图。综合耳蜗图表明，耳蜗外、内毛细胞损失开始出现在底回区域，并随着年龄增长，由底回向顶回发展。3月龄对照组毛细胞损害仅出现在耳蜗基底回钩端处；7月龄对照组毛细胞损失则已延伸至整个耳蜗底回，甚至抵达耳蜗中部；7月龄中药1组和中药2组毛细胞损失较7月龄对照组明显为轻。Fig.2 A and B respectively represent the averaged cochleograms of cochlear outer hair cells and inner hair cells losses from C57BL/6J mice at 3 months of age group and 7 months of age group with drinking tap water group，group 1 with voluntarily and automatically drinking TCM and group 2 with feeding TCM at 7 months of age.They showed that cochlear outer hair cells and inner hair cells losses began from cochlear basal turn and progressed toward apical turn along with the age.Losses of hair cells at 3 months of age controlling group were only in hook region at cochlear basal turn.Losses of hair cells at 7 months of age controlling group had been extended to the whole cochlear basal turn and even reached middle region，however，losses of hair cells at group 1 of TCM or group 2 of TCM at 7 months of age was less by comparison with 7 months of age controlling group.

3　讨论

AHL是听觉器官衰老退变的过程，病因病机错综复杂，目前主要有活性氧代谢物（reactiv oxygen species，ROS）和线粒体DNA（mtDNA）学说；内耳循环和代谢障碍学说；基因遗传和突变学说；环境噪声或药物危害学说等，其中认为AHL与线粒体能量代谢和ROS损害的关系最为密切［8，9］。细胞内90％以上的能量由线粒体提供，能量代谢的主要副产物是ROS，100多种疾病的病理状况（包括衰老）与ROS有关。ROS活性极高，可导致广泛的DNA、细胞和组织损伤。体内的ROS主要来自氧化磷酸化期间的线粒体电子转运体系，在老年时期，耳内部循环系统血流降低，时程延长，血流灌注不足，耳蜗血供明显减少，耳蜗能量将通过氧化磷酸化产生，从而导致耳蜗内ROS大量形成。与细胞核DNA相比，mtDNA没有组蛋白的保护和仅具有有限的自我修复能力，因此mtDNA极易受到ROS的破坏或某些药物副反应损伤。随着年龄增长等因素又使mtDNA的损伤累积，当大量的mtDNA受到损伤时，线粒体功能受到影响，导致细胞缺乏生物能量，这种机制是衰老的线粒体钟理论的基础，也称为衰老的膜假说。已发现AHL与mtDNA损伤有关，也支持线粒体疾病在渐进性听力丧失中起一定作用，AHL病人mtDNA内部发生突变或特异性缺失，这是由于其长期暴露于ROS的结果。另外若mtDNA突变，则导致线粒体能量代谢丧失，最终整个细胞受到损害，所以听觉系统的ROS损伤，mtDNA突变被普遍认为是AHL的重要原因［10，11］。

AHL属中医“渐聋”、“久聋”等范畴。传统中医有肾主耳，肾开窍于耳，“老人之耳，多见聪不内居，而声闻于外，此正肾元不固，阳气涣散之征耳”（《景岳全书·卷二十七·耳证》）；耳属清窍，脾主升清降浊，清阳出上窍，“脾为孤脏，……其不及则令九窍不通”（《素问·玉机真藏论》）；“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上于面而走空窍，······其别气走于耳而为听”（《灵枢·邪气脏腑病形篇》）等观点，因此，笔者认为AHL的中医发病机制应与肾、脾、血脉密切相关。复方健耳剂以中医脾肾瘀立论，选择具有补肾健脾、活血通窍作用的中草药组成，现代中药药理研究表明［12］，其所选药物如骨碎补具有降血脂、抗血栓、强心、改善微循环、以及缺血乏氧脑病有较好的保护等作用。黄芪可提高红细胞膜Na+，K+-ATP酶活性，可使红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，促进抗氧化作用，延长组织细胞寿命，促进核酸蛋白质代谢；提高血浆cAMP含量，抑制血小板功能，扩张外周血管，改善微循环，强心和抗心肌缺血，提高组织细胞耐缺氧能力等。丹参能显著提高血浆及体内器官cAMP含量，抑制血小板聚集和血脂升高，扩张外周血管，改善微循环，提高组织细胞耐缺氧能力。葛根则具有显著改善脑微循环障碍、抗氧化与清除自由基、抗缺氧、抗凝血、和解痉等广泛药理作用。效应很可能与其改善内耳微循环、保护线粒体、补充能量代谢、抗氧化与清除活性氧自由基等多种作用有关。

表1　外、内毛细胞损失各区域占比统计学χ2检验结果Table 1 Statistical χ2test results from regional proportion of outer hair cells and inner hair cells losses

C57BL/6J小鼠是研究人类AHL的理想动物之一，其耳蜗毛细胞在成年期即出现退变，随年龄增长，毛细胞退变从耳蜗基底回不断向蜗顶扩展，到26月龄时，几乎整个耳蜗的外毛细胞和大部分的内毛细胞丧失［13-15］。另据国内报道［16］，通过听性脑干反应检测、HE染色等方法，比较2月龄与10月龄两组C57BL/6J小鼠听力和初级听皮层神经元凋亡变化，再次证实了C57BL/6J小鼠年龄相关的听力损失与初级听皮层神经元凋亡密切相关。最近研究表明［17-19］，若敲除C57BL/6J小鼠线粒体促凋亡基因Bak，可减少与年龄相关的耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元凋亡，从而减低AHL的发生，而提高过氧化氢酶活性，或口服抗氧化剂α-硫辛酸和辅酶Q均可抑制耳蜗Bak基因的表达。研究还发现小鼠AHL与Cdh23基因突变有着密切关系，其中C57BL/6J小鼠Cdh23和SOD1双基因突变或缺失所引起听功能下降和毛细胞损害最为严重。因此认为，促凋亡基因Bak系通过氧化应激反应被活化，从而介导耳蜗神经细胞凋亡，或Cdh23和SOD1突变或缺失，ROS积累，导致耳蜗神经细胞损害是C57BL/6J小鼠AHL发生的关键分子机制之一。10年前的研究曾表明［6，7］，国产代传C57BL/6J小鼠7月龄在耳蜗基底回即出现毛细胞损害现象，越往钩端越重，呈现出向顶回不断蔓延趋势，与以往发表的大多数文献报道相一致。先前在实验中还曾发现，早期临床治聋其中两个验方均具有不同程度延缓C57BL/6J小鼠随着年龄增长而发生的耳蜗毛细胞损害的作用。本次研究进一步证实了这一结论，同时还表明临床优化新配方复方健耳剂具有显著对抗C57BL/6J小鼠老年性耳蜗毛细胞退变作用。前述该主要药物药理研究发现其具有改善微循环，提高SOD活性，促进抗氧化与清除自由基作用，符合针对C57BL/6JAHL有关发病机制的药效解释。过去通过动物初步实验［20］，本研究发现复方健耳剂原始配方，可以提高小鼠耳蜗组织脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。最新在通过对过氧化氢（H2O2）在体外诱导成年大鼠脊髓神经氧化应激反应性损害模型研究中发现，24小时氧化应激导致脊髓神经细胞存活率明显降低，而经过BDNF预处理的48小时脊髓神经细胞内活性氧受到明显抑制，其生存率也明显提高，这种生存效应与凋亡细胞数量的显著减少，与BDNF诱导抗氧化酶谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶活性显著增加密切相关［21］。因此认为，该复方中药有可能通过减少耳蜗ROS和对抗相关基因突变，成为其有效防治耳蜗毛细胞损害的关键机制之一。考虑到实验动物每日饮水量的差别可能影响动物摄取复方健耳剂的剂量，为了确保实验动物按照1.83g/kg/d的剂量服用复方健耳剂，本研究对7月龄中药2组动物从出生后第4个月开始灌喂中药，结果发现无论是自然饮药还是强行灌喂，复方健耳剂都能有效减轻C57BL/6J小鼠老年性耳蜗毛细胞损害，而且这两种用药方法的防治作用并无统计学上差别。这些研究不但为最近发现的复方健耳剂有效保护C57BL/6J小鼠的听觉功能提供了内耳病理学证据，同时还为今后相关研究采用较为方便的自然饮药方法提供了可行性的依据。

该文内容仅限于复方健耳剂对耳蜗毛细胞的保护效应和毛细胞病理学研究报道，其它一系列有关听觉生理学的研究、周边螺旋神经节的病理学研究以及分子生物学研究报道将陆续发表在其它相关杂志，复方健耳剂的保护性作用机制也将有待更深入的研究和确认。

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Protective effects of the Compound Healthy Ear Agent against presbycusis in C57BL/6J mice

XUAN Weijun1，2，DING Dalian1，2，3，JIANG Haiyan3，YANG Kun3，WEI Yulong4，CHEN Zhuang4，TANG Junbo1
1.Department of otorhinolaryngology head and neck surgery，the first clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
2.Department of otorhinolaryngology head and neck surgery，the ruikang clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
3.Center for Hearing Deafness，the State University of New York at Buffalo，USA
4.Pharmaceutical factory，the ruikang clinical medical college of Guangxi university of Chinese medicine
Corresponding author:XUAN WeijunEmail:xuan5352100@sina.com

【Abstract】Objective To investigate the efficacy of the Compound Healthy Ear Agent（CHEA），a traditional Chinese medicine compound product，on age-related cochlear hair cell damage by two different administration methods.Methods Twenty two 1 month old C57BL/6J mice were divided into 4 groups to drink tap water until 3 months of age （young control group，n=4），drink tap water until 7 months of age（presbycusis control group，n=6），voluntarily drink CHEA until 7 months of age（n=6），or voluntarily drink CHEA until 4 months of age，followed by CHEA feeing until 7 months of age（n=6）.At the end of the experiment，the cochlear basilar membrane was micro-dissected out，trimmed and mounted in glycerin on glass slides as flat surface preparations.The number of cochlear hair cells along the entire length of cochlea was counted for cochleograms.The hair cells density at two different locations of interval lesions was statistically analyzed and compared among the four groups.Results Cochlear hair cells in the young control group showed missing cells only at the end of the basal turn.Hair cell missing in the presbycusis control group extended fromthe basal turn to about 40％from the apex.In both CHEA treated groups，the extent and degree of missing hair cells were less compared to the presbycusis control group（P＜0.001）.Conclusion The traditional Chinese medicine compound product CHEA appears to mitigate the development age-related cochlear hair cells damage，with similar results for both administration methods tested in this study.The mechanisms may involve improving microcirculation，eliminating reactive oxygen species and protecting mitochondria.

【Keywords】C57BL/6J mice，presbycusis，hair cells，traditional Chinese medicine

【中图分类号】R764.436

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）02-272-6

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.029

基金项目：国家自然科学基金（地区项目81260552，面上项目81373700）和广西自然科学基金（2014GXNSFAA118162）

作者简介：宣伟军，医学博士，教授，研究方向：耳鼻咽喉科学，光动力头颈外科学

通讯作者：宣伟军，Email:xuan5352100@sina.com

收稿日期：（2015-10-09审核人：郭维维）