TBC1D24基因的致聋机制研究进展

陈鹏辉杨涛1上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉-头颈外科2上海交通大学医学院耳科学研究所3上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室



TBC1D24基因的致聋机制研究进展

陈鹏辉1，2，3杨涛1，2，3
1上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉-头颈外科
2上海交通大学医学院耳科学研究所
3上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室

【摘要】TBC1D24基因编码含TBC结构域和TLDc结构域的蛋白质。该基因具有基因多效性，所涉及的基因型-表型关联复杂，不同突变可分别导致重度-极重度先天性耳聋、迟发性/渐进性耳聋等不同听力表型及在神经、骨骼等系统的不同发育障碍。在内耳中，TBC1D24表达于螺旋神经节及毛细胞静纤毛，具有特异的表达位置和表达时间。对该基因的功能学研究有助于人们了解听觉及神经系统的发育及相关遗传性疾病的分子发病机制。

【关键词】TBC1D24；螺旋神经节；静纤毛；耳聋基因

TBC1D24基因编码含TBC结构域和TLDc结构域的蛋白质。该基因具有基因多效性，所涉及的基因型-表型关联复杂，不同突变可分别导致重度-极重度先天性耳聋、迟发性/渐进性耳聋等不同听力表型及在神经、骨骼等系统的不同发育障碍。在内耳中，TBC1D24表达于螺旋神经节及毛细胞静纤毛，具有特异的表达位置和表达时间。对该基因的功能学研究有助于人们了解听觉及神经系统的发育及相关遗传性疾病的分子发病机制。

1　TBC1D24基因及其蛋白质产物结构

TBC1D24（MIM #613577）是TBC1结构域基因家族的第24成员，位于染色体16p13.3位置。该基因包含8个外显子，其中最长的mRNA编码一个559氨基酸的多肽［1］，第47至262位和第368至554位氨基酸分别编码TBC和TLDc两个保守结构域。

TBC（Tre2/Bub2/Cdc16）结构域蛋白家族是一类Rab GTP酶激活蛋白（Rab-GAP），能够催化特定Rab GTP酶（Rab-GTPase）的GTP水解为GDP［2］，进而调控与GTP和GAP紧密相关的Rab-GTPase的激活与失活状态。Rab-GAPs通过调节Rab-GTPase活性参与调控了众多质膜转运以及囊泡分选过程［3］。TBC1D24基因的第二外显子编码TBC结构域，目前TBC1D24直接靶向作用的Rab-GTPase还未见报道，其蛋白晶体结构仍未知。鉴于大部分TBC1D24基因的致聋病突变位点位于TBC结构域，我们猜测该结构域可能与TBC1D24蛋白在内耳的听觉功能直接有关。

表1　TBC1D24基因突变及其疾病临床表型Table 1 TBC1D24 Mutations and Associated Phenotypes

TLDc结构域蛋白与氧化应激抵抗性相关，且有接触反应活性，但其作用底物尚不清楚［4］。人类存在其他四种含TLDc结构域的蛋白，包括NCOA7和OXR1，这两者均有保护细胞抵抗氧化应激的作用。既往研究发现敲除了OXR1基因的小鼠可产生氧化应激诱导的神经变性［4］。TBC1D24是唯一一个含有TLDc结构域的TBC/Rab-GAP家族成员。因此人们推测TBC1D24的另一个作用有可能为保护神经元细胞抵抗氧化应激。

1.1TBC1D24基因突变的临床表型

TBC1D24在脑、耳蜗、睾丸、骨骼肌、心脏、肾脏、肺和肝脏等许多器官都有表达，具有基因多效性和复杂的突变基因型-表型关联。该基因不同类型的突变可以分别导致癫痫、智力障碍、神经细胞变性等神经系统疾病、指（趾）甲发育不良、骨发育不良及感音神经性耳聋。表1总结了目前国内外研究中已报道的十几种TBC1D24基因突变及其所导致的疾病临床表型。在神经系统疾病中，既往研究分别在一个患有家族性婴儿肌阵挛性癫痫病（MIM #605021）的常染色体隐性遗传家系中发现了两个复合杂合的错义突变（p.Asp147His and p.Ala509Val）［5］，在一个患有局灶性癫痫、构音障碍和轻中度智力障碍综合征（MIM #605021）的家系中发现了纯合的p.Phe251Leu突变［6］，在一个患有家族性婴儿恶性部分性迁移惊厥发作的家系中发现了复合杂合突变p.Cys156X和p.Phe229Ser［7］，在一个患有严重致死性癫痫性脑病（MIM #615338）的家系中发现了纯合的双碱基缺失移码突变p.Ser324Thrfs*3［1］。

新近研究发现TBC1D24基因突变也可以造成非综合征性和综合征性感音神经性耳聋。Rehman等在三个非综合征性隐性耳聋（DFNB86）的家系中分别发现了两个不同的纯合突变p.Asp70Tyr和p.Arg293Pro［8］。另外，一项针对DOORS综合征（耳聋、指（趾）甲变形、骨营养不良、智力发育迟缓、惊厥综合征）的多中心研究选取了来自17个国家的26个患病家系作为研究对象，发现了该综合征与8个纯合或复合杂合的隐性TBC1D24基因突变有关，相关突变包括c.724C＞T（Arg242Cys），c.118C＞T（Arg40Cys），c.1008delT（His336GlnfsTer12*），c.1206 + 5G＞A （Splicing），c.58C＞G（Gln20Glu），c.119G＞T（Arg40Leu），c.328G＞A（Gly110Ser），c.999G＞T（Leu333Phe）［9］。

既往报道的TBC1D24基因突变均为常染色体隐性遗传模式。与之不同的是笔者研究团队新近在一来自中国的显性遗传性的非综合征性耳聋大家系中运用连锁分析和外显子测序的方法发现TBC1D24基因的杂合致病突变p.Ser178Leu（MIM#616044）［10］。有趣的是同一基因突变在同一时间也在另一来自欧美的非综合征性耳聋显性家系中被报道［11］，预示着p.Ser178Leu突变可能为一相对高发、与致聋作用有特殊联系的基因功能性改变。和DFNB86及DOORS综合征的先天性、重度-极重度耳聋不同，TBC1D24基因p.Ser178Leu突变所导致的显性遗传性耳聋起始发病年龄均在20岁之后，听力随年龄增大呈进行性下降且对高频听力影响更为明显［15，16］。

1.2TBC1D24基因突变的致病机制

如上所述，TBC1D24基因突变可影响人体不同组织和器官，导致具有多样性临床表型的不同遗传性疾病。这种复杂的基因性-表型关联据推测应与该基因的基因多效性有着密切联系：TBC1D24蛋白在神经、骨骼和内耳等不同细胞环境下可能与各系统特异的配体或结合蛋白相作用，在不同的生物学通路中执行不同的功能。不同类型的TBC1D24基因突变或使蛋白产物功能完全或部分缺失，或使特异的蛋白功能发生有害的改变，通过影响不同生物学通路以造成不同组织和系统的功能性障碍。

从突变对基因功能的损失类型划分，遗传性疾病基因突变的常见致病机制可分为功能丧失性突变（loss of function）和（有害）功能获得性突变（gain of function）两大类型。多数隐性遗传突变，如TBC1D24基因所报道的一些截断性突变p.C156X，p.Ser324Thrfs*3及p.His336Glnfs*12，可导致基因功能丧失［1，7，9］。这些TBC1D24基因截断性突变的杂合子携带者均为正常临床表型，预示着该基因显性突变的分子致病机制可基本排除单倍体不足（haploinsufficiency）的可能性。由此推测，与显性非综合征性耳聋相关的TBC1D24基因p.Ser178Leu突变非常有可能为一功能获得性基因突变。p.Ser178Leu突变位于TBC1D24基因的TBC结构域，由一疏水性亮氨酸替代亲水性的丝氨酸，而这一替换可能通过影响蛋白的折叠或构造而使蛋白的功能发生有害性改变。以上同一基因不同突变分别导致隐性功能缺失性和显性功能获得性致病机制的例子在其他耳聋基因中是有先例的，如功能全部或部分缺失型GJB2基因突变可导致常见隐性遗传性耳聋DFNB1A，而部分可导致显性遗传性耳聋DFNA3A和综合征性耳聋的GJB2显性突变已被功能学实验证实可获得新的有害性的蛋白功能改变［12，13］。和功能缺失型突变不同，功能获得性突变在基因治疗时无法使用野生型基因置换（gene replacement）的策略，相反一些可以选择性抑制突变等位基因的基因治疗策略，如RNA干扰技术则更具治疗潜力。由此可见，进一步深入研究野生型TBC1D24基因在不同组织和细胞中的具体功能以及不同TBC1D24基因突变的特异性分子致病机制将对把握和理解TBC1D24基因突变的复杂的基因型-表型关系、开发有针对性的基因治疗手段具有重大科学意义［17，18］。

1.3TBC1D24基因在神经发育方面的功能学研究

由于TBC1D24基因突变所导致的神经系统疾病发现在前，目前阶段对于该基因及突变的功能学研究主要集中于其在神经发育方面的影响。Falace等在COS7细胞系中外源表达TBC1D24及ARF6，利用荧光标记共定位及免疫共沉淀实验证明TBC1D24与ARF6存在直接相互作用［5］。ARF6是一类调控细胞膜转运、肌动蛋白网络重建、细胞质膜胞吐胞吞作用的小GTP酶ADP核糖基化因子，其在神经元的主要功能包括抑制树突的分支和轴突的伸长。TBC1D24基因在这方面的功能则与ARF6正好相反：在原代培养的小鼠大脑皮层神经元细胞中过表达野生型TBC1D24可显著地增加神经元突起的长度和分支数量，而过表达p.D147H和p.A509V突变型TBC1D24则无此影响［5］。类似结果在原代培养的小鼠海马神经元中也有报道［6］。以上结果提示TBC1D24可能通过与ARF6的结合而对后者对神经发育的调控起拮抗作用。这一猜测在随后的在体研究中得到进一步证实：通过对胚胎期大鼠TBC1D24基因的RNA干扰沉默，Falace等发现实验动物大脑皮层发育过程中神经元从多极向双极的转变过程受到影响，放射状迁移被延迟，且其形态和功能保留了一些发育不成熟阶段的特征，包括树突分支和兴奋性突触形成方面的减弱；而过表达带有显性负效应（dominant negative）突变的ARF6基因可以扭转TBC1D24沉默所导致的大脑皮层神经元迁移和成熟过程中的缺陷［14］。这些结果说明TBC1D24通过调控ARF6依赖的细胞膜转运通路在神经元的迁移和成熟中起到了重要作用，其作用机理可解释部分TBC1D24基因突变所导致神经系统疾病的分子发病机制［14］。

1.4TBC1D24基因在听觉系统中的表达及功能预测

2014年以来的数篇论文连续报道了TBC1D24基因突变所导致的显性、隐性非综合征性耳聋及综合征性耳聋，提示该基因在听觉系统中具有重要作用［8-11］。有关TBC1D24基因在听觉系统的作用及致聋机制研究目前尚处在初步阶段，已发表的研究成果多在于确定该基因在内耳的具体表达位置和细胞类型。鉴于听觉系统结构的复杂性和内耳不同类型细胞所执行功能的特异性，有关TBC1D24基因在内耳表达方面的信息对推断该基因在听觉系统的功能及可能存在的发病机制具有非常重要的价值。在这方面，Rehman等通过成年小鼠耳蜗冰冻切片的免疫荧光实验发现TBC1D24蛋白表达在出生后第30天小鼠的内耳螺旋神经节，并在螺旋神经节神经元的细胞体和轴突均有分布［8］。根据此结果作者推测TBC1D24基因突变所导致的DFNB86耳聋有可能是一种听神经病谱系障碍（auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD）。听神经病谱系障碍是一种外毛细胞功能正常，而听神经、内毛细胞或内毛细胞神经突触等听觉传入通路的损害而导致的听功能障碍性疾病，其发病之初的临床听力学特点可表现为耳声发射（OAE）正常而听觉脑干反应（ABR）波形或波峰间距异常，随后由于缺乏传入刺激，残留的毛细胞和柯替氏器最终会发生继发性消亡。然而在其他三篇关于TBC1D24基因突变致聋的论文中研究者均未能提供病人发病之初的OAE资料以证实听神经病谱系障碍的假设，本研究团队所报道的一个具有TBC1D24基因显性突变的迟发性、渐行性耳聋家系中部分病人耳声发射结果异常，但这些病人接受听力学检测时年龄偏大，已过发病年龄多年，尚不能完全排除听神经病谱系障碍的可能性。这一问题最终可借助TBC1D24基因敲除或敲入小鼠模型来得到回答。

和Rehman等对成年鼠的表达研究不同，本研究团队同时对新生及成年鼠进行了TBC1D24基因的内耳表达研究。通过不同时期小鼠耳蜗的全组织包埋及冰冻切片免疫荧光实验，我们发现TBC1D24基因除了在螺旋神经节神经元有持续性表达以外，还在新生期表达于内、外毛细胞的静纤毛［10］。该基因在静纤毛上的表达只在小鼠新生期到出生后第3天左右较为明显，在出生后第7天及之后即消失，同时具有时间及空间上的特异性。以上TBC1D24基因内耳表达特征在Azaiez等的研究中也得到证实［11］，预示着该基因可能对毛细胞静纤毛的发育和成熟具有重要作用：在小鼠内耳发育期间，毛细胞静纤毛之间在不同时期存在着很多暂时性的侧壁连接结构，如在胚胎17.5天到出生后第2天期间存在的临时性侧壁连接，在出生后第2到9天期间暂时存在的“踝连接”等。TBC1D24基因产物是否与这些暂时性侧壁连接有关是一个非常值得关注的未来研究方向。

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Research Progress on PathogenicMechanisms of Deafness Caused by TBC1D24 gene

CHEN Penghui，1，2，3YANG Tao1，2，3
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，
2 Ear Institute，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai，China，
3 Shanghai Key Laboratory of Translational Medicine on Ear and Nose diseases，Shanghai，China，200092
Corresponding author:YANG TaoEmail:yangtfxl@sina.com

【Abstract】TBC1D24 gene encodes a protein containing TBC domain and TLDc domain.The pleiotropic gene has a complex genotype-phenotype correlation.Different mutations result in severe-profound congenital deafness or delayed/progressive deafness and developmental disorders of nerve and/or skeletal systems.In the inner ear，TBC1D24 is expressed in the spiral ganglion and the hair cell cilia，which has the specific special and temporal expression pattern.The functional study of this gene will help us to understand the development of auditory and neural system and molecular pathogenesis of related diseases.

【Key words】TBC1D24，spiral ganglion，hair cell cilia，deafness gene

【中图分类号】R764

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）02-299-5

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.035

作者简介：陈鹏辉，在读硕士，研究方向：聋病分子生物学

通讯作者：杨涛，Email：yangtfxl@sina.com

收稿日期：（2015-10-09审核人：郭维维）