滤纸SERS基底的制备及其在精浆分析中的应用

曹刚,黄祖芳*,孙艳,杜生荣,林金勇,林居强,冯尚源,雷晋萍,林宏心,陈荣

(1.医学光电科学与技术教育部重点实验室,福州　350007；2.福建省妇幼保健院,福州　350001)

滤纸SERS基底的制备及其在精浆分析中的应用

曹刚1,黄祖芳1*,孙艳2,杜生荣2,林金勇1,林居强1,冯尚源1,雷晋萍1,林宏心1,陈荣1

(1.医学光电科学与技术教育部重点实验室,福州350007；2.福建省妇幼保健院,福州350001)

摘要:本文介绍浸泡法制备基于滤纸的SERS基底,并分析滤纸SERS基底表面银纳米粒子(AgNP)的分布与浸泡时间的关系。以精浆为检测对象,相比于514 nm波长激发，785 nm激发可获得更好的光谱数据，同时还比较了该波长激发下精浆的常规拉曼光谱与SERS光谱。更为重要的是,通过采用精浆中654 cm-1谱峰强度评估不同浸泡时间下(6 h,12 h,24 h)滤纸SERS基底的增强性能和测量结果的重复性。实验结果表明,12 h浸泡获得的滤纸SERS基底表面具有均匀的AgNP分布,在785 nm波长激发下,纸基SERS基底可提供增强效果及光谱重复性俱佳的精浆SERS光谱。

关键词:表面增强拉曼散射；滤纸；银纳米颗粒；精浆

1引言

表面增强拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)现象于1974年由英国科学家Fleischmann等人[1]在吡啶的电化学实验中发现,由于其不仅克服了常规拉曼光谱存在的信号弱、易受干扰等缺点；同时还兼具高检测灵敏度等优点,因而引起人们的广泛关注。近几十年来,SERS光谱技术已发展成为生物医学研究领域强有力的工具之一[2-4]。增强基底既是检测物的承载基底,同时又影响着检测信号的增强,其研究进展很大程度上决定了SERS光谱技术的发展。获得稳定、重现性好的SERS光谱信号是SERS研究领域的重要目标和现实挑战。目前,金属溶胶由于其增强效果好、稳定性高、容易制备等优点已经成为实验室及相关检测常用的SERS增强基底[5-7],然而金属胶体会随着放置时间增加产生无序聚集,容易影响光谱的重复性,更不适合定量测量；采用电子束光刻[8]、热沉降[9]等方法制备的SERS基底,虽可获得高重复性的光谱数据,但基底造价通常比较昂贵,并且固体基底坚硬易碎的缺点会降低样品的收集效率,因此有必要发展廉价、易用同时兼具高灵敏性的SERS基底。

近几年来,基于滤纸制备的SERS基底研究广获关注。滤纸质地柔软多孔,便宜易得,且具有强亲水的特性,因而是适合应用于生物医学领域检测研究的一种多功能载体。Yu等人[10]利用打印机在纤维素纸上打印AgNP,从而获得快速、简单制备的SERS基底；此外,Qu[11]等人采用丝网印刷(screen painting)的方式快速制备出重复性较好的一次性SERS基底；相比之下,利用浸泡法将金或银胶体粒子组装在滤纸上,从而制备出性能良好的SERS基底也有报道[12-14]。浸泡法可获得更好的增强效果[12-13],然而浸泡法制备所需时间较长(1～2天),且目前这些研究通常主要关注于增强性能的评估,鲜见针对人体体液的检测研究报道。

基于拉曼技术的精液检测分析以及精液质量评估[15]，法医学上犯罪现场体液样品的区分鉴别[16]已获得初步的研究结果,体现了拉曼检测方法的优点,使用滤纸SERS基底进行精液SERS光谱检测未见报道。滤纸在结构和材料上具有独特的优势使得滤纸SERS基底兼具滤纸的高样品收集率和SERS基底的高检测灵敏度的优点,有望为体液的检测分析提供简单、高效的新方法。

因此,本文采用将滤纸浸泡于浓缩的银胶溶液中进而制备出滤纸SERS基底,并对基底表面AgNP的分布状况随时间变化的关系做了详细的研究。另外还通过精浆样品的SERS光谱检测,比较了两种激发波长(514 nm和785 nm)在这种基底上的测试效果,初步探讨了滤纸SERS基底相关检测参数的优化，及用于精浆体液检测的前期可行性研究。

2实验部分

2.1试剂

硝酸银(AgNO3)购自上海试剂一厂,盐酸羟胺(HONH3Cl)购自国药集团化学试剂有限公司,氢氧化钠(NaOH)购自天津市永大化学试剂有限公司。实验中所用试剂均为分析纯。配制溶液和实验中均使用超纯水(Milli-Q,电阻率18.2 MΩ·cm)。

2.2银胶和样品的准备

银胶的制备参照Leopold和Lendl[17]文献的方法,即采用盐酸羟胺还原硝酸银的方法制备。制备好的胶体在离心机以10000 r/min速度离心10 min,使银胶分层,移液枪吸弃95%的上层清液,获得20倍浓缩的银溶胶,室温下避光保存备用。透射电镜统计结果显示,该方法制备的AgNP粒径为34±5 nm。

人体精液样品由福建省立医院检验科提供,待精液液化后,精液样品以3000 g离心力离心10 min,吸取上层精浆样品装入容量为1.5 mL的离心管内,置于-80℃冰箱冷藏备用。

2.3纸基SERS基底的制备

实验中所用滤纸为英国GE医疗有限公司的Whatman 3# 滤纸。首先将滤纸剪成直径2 cm的圆纸片,再将圆纸片分别放入装有1.5 mL浓缩银溶胶的培养皿中浸泡不同时间(6 h、12 h、24 h),随后用干净镊子把浸泡后的滤纸夹到吸水纸上,快速吸走多余的水分和滤纸表面不固定的AgNP,将获得的SERS基底在室温下晾干20 min备用。

2.4实验测试

为了详细表征和评估AgNP在滤纸基底表面的分布状况,我们使用JEOL JSM-7500F场发射扫描电子显微镜(filed emission scanning electron microscopy,FE-SEM)分别测得不同处理条件下的滤纸SERS基底10000倍放大的电镜图。

SERS光谱测试时,吸取10μL精浆样品滴加在SERS基底上并于室温下干燥10 min。测试所用仪器为装配有785 nm和514 nm两种波长的激光器的英国Renishaw公司Invia型共聚焦显微拉曼光谱系统,光谱的测量范围是600～1800 cm-1,20倍物镜,积分时间为10 s,曝光1次。仪器自带的WiRE 3.4软件测得的原始光谱数据先使用Zhao[18]等人提出的方法进行基线校正,然后在600～1800 cm-1的光谱范围内进行归一化处理。

3结果与讨论

实验中选用滤纸制备SERS基底一方面是由于滤纸的主要成分是纤维素,与其他种类的纸相比,滤纸只有很弱的背景信号[10],更重要的是,滤纸质地柔软多孔并且具有很强的亲水性,这种结构对金属纳米粒子的吸附以及对含水样品的快速吸收和浓缩具有非常重要的作用。滤纸在浸泡于浓缩的银溶胶前为白色,随着浸泡时间的延长,滤纸颜色逐渐变为深灰色,这意味着有更多的AgNP吸附在滤纸上,在图1(A)的扫描电镜图中可以看出,滤纸纤维呈现出一种互相缠绕的网状结构,正是这种结构为金属纳米粒子的扩散和固定提供了很大的表面积和毛细作用力支持,而且这种形态有利于AgNP形成层内和层间的等离子体耦合,而后者对SERS信号的增强起到了极大地作用[13]。在图1(B～D)中可以看到,随着浸泡时间的延长,AgNP在滤纸上分布越来越密集和均匀,这种结构往往有利于得到重复性良好的SERS光谱。

Fig.1　FE-SEM images of filter paper after dipping into concentrated silver colloids for(A)0 h(B)6 h(C)12 h(D)24 h

鉴于滤纸基底具备的良好结构特性,我们以体液中常见的精浆为检测对象评估这种基底的增强效果。虽然之前的研究表明常规拉曼光谱可用于精液、精浆的质量分析和法医学上犯罪现场体液样品的识别[15-16],然而精液中的大蛋白分子容易对拉曼信号产生干扰,因而常规拉曼的原始光谱信号较弱,信噪比较低,SERS技术可以克服常规拉曼测试的不足,提供更高的检测灵敏度。图2所示为785 nm的激发光在同一测试条件下原始精浆样品的常规拉曼光谱(A)与滤纸基底上测量获得的SERS光谱(B)的比较,图3比较了经过基线校正和归一化处理后的两种拉曼光谱。可以看出,精浆样品在SERS基底上的拉曼信号获得显著的增强,而精浆的常规拉曼信号较弱,谱峰较少,荧光背景强。而在滤纸SERS基底上进行SERS检测时,类似于血浆与AgNP的相互作用[7]，精浆中的生化成分与AgNP相互作用,使得其拉曼信号获得了极大地增强。在图3中的SERS光谱可以观察到数条主要的谱峰,包括654,724,956,1131,1212,1327,1455,1572,1649 cm-1等,根据相关文献的结果[3,15,19],表1列出了这些主要峰位对应的的谱峰归属,可见,光谱轮廓及谱峰位置与之前的研究结果[3]类似,而谱峰强度的差异主要是由于样品中不同物质成分浓度变化造成的。值得注意的是,滴加在滤纸基底上的精浆会由于滤纸的吸水作用而很快变干,这种扩散作用使得样品得到快速浓缩并且使样品分子可以与AgNP充分接触,从而获得更好的测试结果；从这方面考虑,滤纸SERS基底进行体液SERS测试比传统固体SERS基底更高效。

Fig.2　Raw Raman spectra of seminal plasma(A)Normal;(B)SERS

Fig.3(A)Normal Raman spectrum of seminal plasma;(B)SERS spectrum of seminal plasma based on paper SERS substrate

Tab.1　SERS peak positions and their tentative peak assignments

为了比较滤纸基底在不同激发波长下的测试效果,实验中分别使用波长为514 nm和785 nm的激发光进行精浆样品的SERS光谱检测。图4所示为滤纸SERS基底分别在514 nm和785 nm激发下的背景信号；由图可见,基底在600～1800 cm-1的区域内无拉曼干扰信号,只为荧光背景,这表明滤纸SERS基底在生物信息丰富的“指纹”区域(600～1800 cm-1)对样品测试几乎不存在影响。图5为在两种激发波长下获得的精浆样品原始SERS光谱图,比较A(514 nm激发)和B(785 nm激发)两条谱线可以看出,主要谱峰基本一致,但是514 nm激发光下的精浆SERS光谱显示出很强的荧光背景干扰,这表明波长514 nm的激发光在光谱测量过程中胶体并没有充分地淬灭荧光背景信号；相比之下,785 nm波长的激发光可获得背景干扰小,谱峰更为丰富的SERS光谱数据,因而波长为785 nm的激发光更适合进行精浆SERS光谱的测量。

扫描电镜的观察虽可提供滤纸于不同浸泡时间下AgNP在滤纸表面的客观分布情况,然而为了全面和有效的评估精浆样品在不同时间浸泡处理后的滤纸上的SERS光谱表现,实验中我们选取精浆SERS光谱中最强谱峰654 cm-1的强度来表征和比较浸泡不同时间的SERS基底的增强效果。具体实验操作如下:激光功率为2.2 mW,每个测试样品的中心区域选取三个不同位置点分别测量获得三条光谱。将获得的光谱数据统一扣除荧光背景后,计算获得654 cm-1峰位光谱强度的平均值和标准差。如图6所示,654 cm-1谱峰强度值随浸泡时间的增加呈明显的递增趋势,在浸泡24 h时强度达到最大,这与扫描电镜下AgNP颗粒在24 h处具有最大的密度分布相符,同时从标准差值可以看出654 cm-1谱峰强度的相对误差逐渐减小,这主要是由于浸泡时间的增加使滤纸上的AgNP密度增加,同时总体上分布更为均匀。值得一提的是,我们发现浸泡时间为24 h比12 h的标准差稍大一些,可能是随着浸泡时间的增加,局部区域AgNP粒子密度分布增加的同时,形成一定厚度的聚集。因而虽然“热点”数量增加,但是局部分布不均匀,进而导致信号强度在不同位置点的变化的增大。本文所采用的方法获得了与Hasi等人[14]报道的类似结果,SERS基底表面具有相似均匀度的银纳米粒子分布,据估算浸泡12 h后,滤纸SERS基底的增强因子可以达到104～105数量级。更为重要的是,通过测量滴加在12 h浸泡的滤纸SERS基底上的精浆SERS光谱,以精浆SERS谱峰中最强谱峰654 cm-1的强度进行统计分析,计算获得的相对误差仅为8%,因而浸泡12 h处理的滤纸SERS基底足以确保获得重复性较高的精浆SERS光谱。

Fig.4Background signal of filter paper-based SERS substrates under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

Fig.5Raw SERS spectra obtained from seminal plasma sample under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

值得注意的是,在进行SERS光谱测试时,体液样品在滤纸基底上大范围的扩散有可能会影响光谱测试时信号的收集效率,另外,采用浸泡法制备SERS基底的时间相对较长,制备出的基底会由于AgNP被氧化而降低SERS活性[20]。因此,寻找一种既能缩短基底制备的时间又能确保高增强效率的滤纸SERS基底的制备方法,以及控制样品在基底上的扩散范围将是接下来主要开展的工作。

Fig.6Comparison of Raman peak intensity at 654 cm-1using 785 nm excitation laser

4结论

本文初步研究了浸泡法制备基于滤纸的SERS基底其表面AgNP的分布状况与浸泡时间的关系,从电镜图中可以看出,随着浸泡时间的增加,AgNP的密度也随之增加。浸泡法提供了一种便捷的方式来制备出简单有效并具有较好SERS活性的基底,通过对比785 nm和514 nm两种不同激发光激发的精浆SERS光谱发现，785 nm激发可获得更好的精浆SERS光谱，与传统拉曼光谱相比,这种纸基SERS基底具有很好的增强效果,并且使用滤纸SERS基底可以获得重复性较好的SERS光谱。通过对滤纸基底上精浆SERS光谱的检测,并进一步优化滤纸基底的性能,进而有望将滤纸SERS基底拓展到其它体液如血液、尿液等的临床检测分析。可以预见这种基于滤纸制备的SERS基底有望在将来应用于犯罪现场体液的原位检测以及临床上基于体液的疾病快速检测。

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Preparation of Filter Paper-Based Surface-Enhanced Raman Scattering(SERS)Substrate and Its Application for Seminal Plasma Analysis

CAO Gang1,HUANG Zu-fang1*,SUN Yan2,DU Sheng-rong2,LIN Jin-yong1,LIN Ju-qiang1,FENG Shang-yuan1,LEI Jin-ping1,LIN Hong-xin1,CHEN Rong1

(1.KeyLaboratoryofOptoElectronicScienceandTechnologyforMedicine,MinistryofEducation,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China;2.FujianMaternalandChildHealthHospital,Fuzhou350001,China)

Abstract:This article introduced a filter paper-based SERS substrate through soaking method,and investigated the relationship between the distributions of silver nanoparticles(AgNPs)on the filter paper with soaking time in detail.SERS spectra of seminal plasma under different excitation wavelengths(514 nm and 785 nm)were compared,and the latter was confirmed to demonstrate better SERS signals.SERS and normal Raman spectra of seminal plasma using 785 nm excitation laser was compared as well.More importantly,the intensity of the strongest peak(654 cm-1)from SERS spectra of seminal plasma was used to evaluated the enhancement effects and signal reproducibility with filter paper SERS substrates under different soaking time(6 h,12 h,24 h).Our results indicated that the AgNPs on the paper substrate soaked with concentrated AgNP colloid presented a relatively uniform distribution at the soaking time of 12 h and the substrate demonstrated high Raman signal enhancement and good signal reproducibility as well.

Key words:surface-enhanced Raman scattering;filter paper;silver nanoparticles;seminal plasma

文章编号:1004-5929(2016)02-0106-06

收稿日期:2015-06-15; 修改稿日期:2015-09-12

基金项目:国家自然科学基金(61308113)；福建省自然科学基金(2013J01225，2014J01399)

作者简介:曹刚(1990-),男,硕士,主要从事表面增强拉曼散射基底的制备及性能研究。E-mail:caogang0648@163.com 通讯作者:黄祖芳,E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn

中图分类号:O433.4

文献标志码:A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201602002