滋肾通关胶囊质量标准研究

刘东顺 熊筱娟 吴志军 朴淑娟 陆文铨

摘要：目的 建立滋肾通关胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对制剂中知母、黄柏进行定性鉴别。采用高效液相色谱法同时对制剂中新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱进行定量检测。结果 通过薄层鉴别分别检出知母中的芒果苷、黄柏中的盐酸黄柏碱。新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱分别在0.025 25～2.02 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 7）、0.026～2.08 ?g（r=0.999 7）、0.025 5～2.04 ?g（r=0.999 6）范围内有良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.99%、101.06%、103.05%、100.55%，RSD分别为2.69%、5.62%、2.49%、2.06%。结论 本方法准确、快速、稳定、可靠，重复性好，可用于该制剂的质量控制及评价。

关键词：滋肾通关胶囊；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；新芒果苷；盐酸黄柏碱；芒果苷；盐酸小檗碱

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.027

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）07-0104-04

Study on Quality Standard for Zishen Tongguan Capsules LIU Dong-shun1，2， XIONG Xiao-juan2， WU Zhi-jun1， PIAO Shu-juan1， LU Wen-quan1 （1. Changzheng Hospital， Second Military Medical University， Shanghai 200003， China； 2. College of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun 336000， China）

Abstract： Objective To establish a quality standard for Zishen Tongguan Capsules. Methods Anemarrhneae Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex were qualitatively identified by TLC method. The contents of neomangferin， phellodendrine hydrochloride， mangiferin and berberine hydrochloride in Zishen Tongguan Capsules were quantitatively determined by HPLC method. Results The spots of qualitative identification method were clear without interference. Neomangferin in Anemarrhneae Rhizoma and phellodendrinehy drochloride in Phellodendri Chinensis Cortex were identified. Neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride showed good linearity in the range of 0.025 25–2.02 ?g （r=0.999 7）， 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 7）， 0.026–2.08 ?g （r=0.999 7）， and 0.025 5–2.04 ?g （r=0.999 6） respectively. The average recoveries of neomangferin， phellodendrinehy drochloride， mangiferin and berberine hydrochloride were 99.99%， 101.06%， 103.05%， and 100.55%， respectively. The RSD were 2.69%， 5.62%， 2.49%， and 2.06%， respectively. Conclusion The method is accurate and rapid， with good stability， reliability and reproducibility， which can be used for the quality control and evaluation of the preparation of Zishen Tongguan Capsules.

Key words： Zishen Tongguan Capsules； quality standard； TLC； HPLC； neomangferin； phellodendrinehy drochloride； mangiferin； berberine hydrochloride

滋肾通关胶囊由知母、黄柏、肉桂等中药提取加工而成，处方出自李东垣《兰室秘藏》，适于“不渴而小便闭，热在下焦血分也”，具有滋肾清热、化气通关之功，用于治疗热蕴膀胱之小腹胀满、尿闭不通。现代研究发现该方在治疗前列腺增生、预防尿路感染、治疗肝硬化腹水等方面也有一定疗效[1-3]。芒果

基金项目：军队医疗机构制剂标准提高计划（14ZJZ04-1）

通讯作者：陆文铨，E-mail：lwqp@163.com

苷和新芒果苷为知母清热作用的主要有效成分，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、利尿、预防肥胖、免疫抑制等作用[4-7]；黄柏中的盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱既是其活性成分又是指标成分[8]。为更好控制该制剂质量，本研究采用TLC对方中知母、黄柏进行定性鉴别，采用HPLC对方中新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱进行定量检测。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent，美国），包括G1311C输液泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G4212B-DAD紫外检测器、Chemstation色谱工作站；十万分之一天平（Sartorius CPA225D，德国）；旋涡振荡混和器WL-901 Vortex（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；超声仪（SK7200H型，上海科导超声仪器有限公司）。

滋肾通关胶囊（批号140429、140430、140431），解放军第二军医大学上海长征医院制剂中心研制；芒果苷对照品（批号MB6776），大连美仑生物技术有限公司；新芒果苷对照品（批号15011309），上海士峰生物科技有限公司；盐酸黄柏碱对照品（批号111895-201303）、盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212），中国食品药品检定研究院；知母对照药材（批号130801）、黄柏对照药材（批号130901），安徽亳州利锋药业有限公司；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 知母

取3批研细后的本品内容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液浓缩至干，残渣用90%甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液。另取知母对照药材1 g，加90%甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至干，残渣用90%甲醇5 mL溶解，作为对照药材溶液。另取缺知母的阴性样品，同法制得阴性对照溶液。另取芒果苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B][9]试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各4 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1∶7∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视[10-11]。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品在相应位置上无干扰。

2.2 黄柏

取3批研细后的本品内容物各1 g，各加90%甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液浓缩至干，残渣用90%甲醇5 mL溶解，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材1 g，加90%甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液浓缩至干，残渣用90%甲醇5 mL溶解，作为对照药材溶液。另取缺黄柏的阴性样品，同法制得阴性对照溶液。另取盐酸黄柏碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅵ B][9]试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各4 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-水-甲酸（4∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液[12-13]。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品在相应位置上无干扰。

3 芒果苷含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m，柱号201054653）；流动相：乙腈?0.1%磷酸（1000 mL加50 ?L二乙胺），梯度洗脱（0～10 min，2%～11%乙腈；10～21 min，11%乙腈；21～22 min，11%～9%乙腈；22～30 min，9%乙腈；30～34 min，9%～24%乙腈；34～50 min，24%乙腈；50～60 min，24%～60%乙腈），2次进样之间用初始流动相平衡10 min；检测波长：265 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 ?L。

3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取新芒果苷对照品2.02 mg、盐酸黄柏碱对照品2.04 mg、芒果苷对照品2.08 mg、盐酸小檗碱对照品2.04 mg，分别置于1 mL棕色容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min使溶解，放至室温，定容，制得对照品溶液。精密量取各对照品溶液适量，加初始流动相混匀定量稀释成每1 mL含新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱分别为404、408、416、408 ?g的混合对照品贮备液，经0.45 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，备用。

3.3 供试品溶液的制备

取滋肾通关胶囊内容物约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率200 W，频率53 Hz）30 min，放冷，再称定质量，用90%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

3.4 阴性对照品的制备

取除知母、黄柏外的其他药材，按“3.3”项下方法制备，即得。

3.5 空白试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按上述方法进样，结果阴性对照无干扰。色谱图见图1。

3.6 线性关系考察

将混合对照品储备液用初始流动相逐级稀释成相当于1/2、1/8、1/10、1/20、1/80、1/160浓度混合对照品贮备液的系列溶液，分别吸取10 ?L注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，以峰面积对浓度（?g/mL）进行线性回归计算，得线性回归方程。各对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系，结果见表1。

3.7 精密度试验

取混合对照品溶液，进样10 ?L，重复进样6次，在上述色谱条件下测定，记录峰面积，结果新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.55%、0.55%、0.43%、0.45%，表明仪器精密度良好。

3.8 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号140429），分别于0、2、4、8、12、24 h分别样测定峰面积，结果新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为3.83%、2.45%、2.65%、2.34%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

3.9 重复性试验

取同一批滋肾通关胶囊（批号140429），精密称取6份，按“3.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.43%、1.11%、0.78%、0.62%，表明该方法重复性良好。

3.10 加样回收率试验

分别精密称取6份已测定含量的样品，置于具塞锥形瓶中，精密加入一定量的混合对照品，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 ?L，记录峰面积，计算回收率，结果见表2。

3.11 样品含量测定

取样品3批，按“3.3”项下方法每批制备3份供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，分别代入回归方程，计算样品中各成分含量，结果见表3。

4 讨论

中药成方制剂通常由多味药组成，其药效是多种活性物质综合发挥作用的结果，若只对单味药或单一成分进行检测，难以全面控制制剂的内在质量。本试验采用TLC对处方中的知母、黄柏进行定性鉴别，采用HPLC同时测定滋肾通关胶囊中新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱的含量，结果稳定可靠，方法简便可行，能够有效控制该制剂的质量。

试验比较了超声提取和回流提取2种方法制备供试品溶液，所测各成分含量无明显差异，因超声法具有操作简便、提取效率高等优点，故选用超声提取法；筛选提取溶剂时考察了甲醇、90%甲醇、75%甲醇，结果90%甲醇提取效果较好；考察了超声提取30、40、50 min的提取效果，结果相当[14]。故确定90%甲醇为提取溶剂，超声提取时间为30 min。

通过DAD检测器对供试品色谱200～400 nm进行光谱扫描，结果显示新芒果苷、盐酸黄柏碱、芒果苷、盐酸小檗碱最大吸收波长分别为258、284、258、265 nm。由于滋肾通关胶囊中新芒果苷、盐酸黄柏碱含量较低，为了兼顾新芒果苷、盐酸黄柏碱的检测准确度，故选择265 nm为检测波长，在此波长处4个成分均可得到满意的灵敏度。

流动相考察中，选择了乙腈-乙酸[15-16]、乙腈-磷酸盐[17]、甲醇-磷酸[18]系统进行比较。结果表明采用乙腈-磷酸盐系统能达到完全分离并且峰形较好，故选择乙腈-磷酸盐系统作为流动相。

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（收稿日期：2015-08-14）

（修回日期：2015-08-23；编辑：陈静）