马冷冻吸管精液制作方法



马冷冻吸管精液制作方法

优质种公马价格非常昂贵，如果采用自然交配的方法，公马不仅利用率低还容易传染生殖系统的疾病。为最大限度的提高种公马利用率，减少种公马感染生殖系统疾病的几率，在实际生产中往往使用人工授精的方式。一匹种公马1次采精的精液量至少可以交配10～100匹母马，但是当天不可能有这么多母马同时发情，为了减少精液的浪费，就必须制作吸管精液冷冻保存，以备今后使用或远距离运输。

1 采精

1.1 采精前的准备

假阴道的准备：采精前向假阴道内胎夹层灌入40～42℃热水1 500～3 000 mL，而后在假阴道入口前1/3段用玻璃棒均匀涂抹润滑剂，再充气调试内腔压力，使内胎呈“Y”字型，入口为较浅的漏斗状为宜。灌水量、内腔充气压力视公马阴茎的粗细、长短调整。采精时内胎温度应保持37～39℃。

台马的准备：选择与种公马相匹配、健康温顺、营养良好的台马，保定绳保定，用绷带布包扎整个马尾并拉系于马体左侧，依次用2%来苏儿液和清水清洗后躯和外阴部，用干净纱布或毛巾擦干。

1.2 采精方法

将种公马牵至采精场，以台马刺激其性欲。阴茎勃起后，用温热的2%碳酸氢钠溶液擦洗生殖器及包皮，温开水冲净后用干净纱布擦干。采精时，采精员右手持假阴道把柄并靠在右臂肘处，公马爬跨时立即站于台马右后侧，左手辅助将阴茎导入假阴道内，假阴道以30～35°固定于台马尻侧；公马射精后，将假阴道的集精杯端放低并打开活塞放气，充分排精后，缓慢将假阴道竖起并移开，迅速送验。

1.3 采精频率

成年公马每周采精不超过6次，连续采精不超过3次；青年公马每周1～2次。

2 精液品质检查

取下集精杯，用玻璃棒挑除副性腺，用4层无菌纱布或专用滤网过滤，在37～38℃环境下进行检查。

2.1 外观检查

射精量：用量杯测量精液量。色泽：正常情况下为淡乳白色或灰白色，带有淡绿色、淡红色、黄色、红褐色等异常颜色的精液应废弃。气味：新鲜精液略有腥味，气味异常的应废弃。pH值检测：用精密pH试纸或pH计检测，正常精液为弱碱性，一般pH为7.0～7.4。

2.2 显微镜检查

精子活率评定：检查时以滴管或灭菌玻璃棒蘸取1滴精液，放在载玻片上加盖玻片，在400～ 600倍显微镜下观察，每个滴片不得少于3个视野，观察不同层次内的精子运动情况，求其活力的平均值。显微镜载物台温度应保持37～38℃。精子活率评定方法见表1。精子活率<0.3的精液应废弃。

表1 精子活率十级评定方法

精子密度检查：种公马连续采精10次应测定1次精子密度。血细胞计数器测定法：用白细胞细管吸取一定的原精，再吸取3%氯化钠溶液将原精稀释10倍，混合均匀后，用细胞计数器在显微镜下放大400倍计数，计算每mL精液中的精子数。目测评定法：分“密”“中”“稀”3级，“密”精子间空隙很小，每mL精液中约有精子数2亿个；“中”精子间空隙明显，含精子1～2亿个·mL-1；“稀”精子空隙超过两个精子的长度，<1亿个·mL-1。

精子畸形率检查：抽样检查精子畸形率。取精液样本放在载玻片上，按常规方法制成抹片，风干后在显微镜下放大400～600倍下检查200～500个精子，观察畸形精子数，计算畸形精子的百分率。马的精子畸形率>15%时不能用于输精，应废弃。

存活时间检查：应经常检查采精种公马的精子存活时间。常温保存：在15～20℃保存，精子存活时间应>48 h。低温保存：在0～5℃保存，精子存活时间应在2～3 d。

2.3 精液品质检查记录

精液品质检查记录表包括配种站名称、种公马号、年龄、品种、毛色特征、采精日期、采精量（mL）、颜色、气味、pH、密度（亿个·mL-1）、活率、稀释液种类、稀释后活力、输精量、输精母马数、采精员、检测员及备注。

3 精液稀释

原精存放时间应≤20 min，精液品质检查后应尽快稀释。

3.1 稀释液的配置和准备

稀释液可自行配置，也可用专用稀释液。稀释液常用配方见表2。

表2 稀释液常用配方

鲜马奶要用6层纱布滤入烧瓶内，放在水浴锅内煮沸10～15 min后，冷却除去奶皮（用6层消毒纱布过滤）。奶粉稀释液要沸煮灭菌，冷却后，用6层消毒纱布过滤除去奶皮。稀释液用前20 min置于37～38℃水浴锅中预热备用。

3.2 稀释倍数

根据精液密度及活率确定适宜的稀释倍数，一般≤4倍。精液稀释后，精子数≥5×1010个·mL-1。

3.3 精液稀释方法

精液应采用等温稀释，稀释液的温度以精液温度来调节，二者温差≤1℃。稀释时，将稀释液沿量杯内壁缓慢加入到精液中，并使用玻璃棒混合均匀。

4 马细管冻精制作技术

马细管冻精制作的步骤为活力评定参见精液品质检查，对达不到要求的精液废弃，对达到标准的继续以下操作；鲜精过滤，将采集达到标准的马匹精液用消毒过的纱布过滤存于烧杯中；稀释，稀释液按照3.1准备，如果精液较稀，以1ϑ1进行稀释，如果较稠以1ϑ1.5进行稀释；离心，将稀释后的精液封装到离心管中，以转速1 500～2 000 r· min-1离心20 min，然后抽取上清废弃，仅留下层精子，集中以待二次稀释；二次稀释，稀释液由基础液+保护液组成，在18～25℃（与精子等温）等比例稀释；装管平衡，将二次稀释过的精液在显微镜下检查精子活力，对活力达不到要求的废弃，对达标的装入细管，放入冰箱中2～5℃平衡60 min，让精子、稀释液和保护液充分混合；冷冻，将平衡后的细管至于零下90～105℃中冷冻3 min，然后至于-140℃冷冻6 min，整个冷冻过程控制在9 min以内；保存，将细管精液按照编号至于液氮罐中，定期检查细管精液的损坏和液氮的消耗；解冻最佳温度为42℃，解冻时间为8 s。

（新疆塔城地区畜牧科技研究推广中心，周军）