桑细菌性枯萎病的病原诊断与病因分析

周勤，王汉荣，谢关林，吕志强，叶伟清，梅洪飞，林宝义

（1.浙江省种植业管理局，浙江杭州 310020；2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310020；3.浙江大学生物技术研究所，浙江杭州 310020；4.浙江省农业科学院蚕桑研究所，浙江杭州 310020；5.桐庐县农业技术推广中心，浙江桐庐 311501；6.临安市农技推广中心，浙江临安 311300）

桑细菌性枯萎病的病原诊断与病因分析

周勤1，王汉荣2，谢关林3，吕志强4，叶伟清5，梅洪飞6，林宝义1

（1.浙江省种植业管理局，浙江杭州 310020；2.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310020；3.浙江大学生物技术研究所，浙江杭州 310020；4.浙江省农业科学院蚕桑研究所，浙江杭州 310020；5.桐庐县农业技术推广中心，浙江桐庐 311501；6.临安市农技推广中心，浙江临安 311300）

本文系统介绍了发生在浙江省临安市、桐庐县和淳安县的桑“枯萎”病害的症状，引起病害的2种病原菌“桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）”研究情况和检测技术；通过大量的调查，系统分析了桑“枯萎”暴发的主要原因是桑树品种抗性不强、适温高湿环境条件、桑园农事操作和病区的砂性土壤和土壤酸化等。

桑“枯萎”；病原诊断；发病原因分析；浙江省

浙西蚕区是浙江省优质蚕茧的重点产区，其中临安、桐庐、淳安3县（市）的蚕茧产量约占全省蚕茧总产量的20%。2006年，临安市和桐庐县的部分桑园中，出现了由零星点状的桑树枯萎死亡到迅速扩大蔓延成片枯萎死亡的现象，发病面积达396 hm2。该病初现时，桑树顶端叶片萎蔫，继而叶片渐渐青枯、脱落，桑树整株枯死；“枯萎”症状的桑树茎杆外表正常，解剖观察枝条、根系的木质部，有褐色条状斑，严重的木质部褐变。蚕农经济损失十分惨重，影响蚕桑产业的持续稳定发展。经浙江大学、浙江省农科院和浙江省农业厅等有关单位专家初步诊断为桑青枯病。桑青枯病具有发病急、蔓延快、毁灭性等特点，曾是我省检疫性病害。该病最早于1968年在广东省顺德市发生，我省也于1992年在衢州市衢县等地发生，对当地蚕桑生产造成了重大损失。但在随后的调查研究中，发现桑园中还出现了与桑青枯病症状略有差别的枯萎症状，经有关专家商讨后将两种症状的病害统称为桑细菌性枯萎病（下同）。2009年淳安县也开始出现类似桑青枯病的病株。为了进一步探明3县（市）桑园中发生的病害，研究开发有效的防控技术，2008年12月5日，浙江省农业厅和财政厅将“突发性桑树急性枯萎病防控技术的研究与推广”列为“2008年度省‘三农五方’科技协作计划项目”。随后，原浙江省农业厅经济作物管理局（2013年起为浙江省种植业管理局）、浙江大学生物技术研究所、浙江省农业科学院蚕桑研究所和植物保护与微生物研究所、桐庐县农业技术推广中心和临安市农技推广中心组成了桑细菌性枯萎病防控技术协作攻关组，并积极争取其他科技项目的支持，联合开展了病原菌、检测技术、防控技术等相关研究工作。本文主要对桑细菌性枯萎病症状、病原菌和发生原因进行分析。

1 病害诊断

1.1 桑细菌性枯萎病的发病症状

从实地调查情况看，发病桑园病株呈点、块状发生，有明显的发病中心，在5月底至11月间发病严重。吕志强、王汉荣、周勤等［1］通过田间对桑细菌性枯萎病病株的发病症状进行系统观察，并对人工接种的农桑14号（从桐庐县和临安市发病桑园采集和分离纯化的桑细菌性枯萎病菌）发病病株进行观察，探明了桑细菌性枯萎病发病症状。表明：部分幼龄桑发病初期桑树顶端叶片在中午萎蔫，清晨与傍晚恢复正常，反复几天后桑树叶片渐渐青枯、脱落，甚至枯死，植株死亡速度较快，部分后期发病桑树病叶从下而上出现枯黄并脱落现象，造成“光杆”。“枯萎”症状的桑树茎杆外表正常，没有腐烂、气生根等现象，在田间将“枯萎”症状桑树植株拔起，地下根部外表正常。解剖观察发现：轻度“枯萎”症状的植株茎、枝条、根系的木质部有褐色条状斑，严重的则木质部褐变。病株根及茎杆保湿培养，没有霉状物等产生。将“枯萎”桑树的枝条和根进行切片镜检观察，发现有明显的喷菌现象，明确为细菌病害。

田间调查发病成林桑（3年以上），开始部分枝条中上部叶片或叶片的叶尖、叶缘失水，逐步呈青枯、褐色干枯，并扩展到全株；枝干和根部症状与幼林桑相同，但死亡速度较慢，部分桑树当年恢复生长，但生长势急速下降，第2年逐步死亡。部分桑树夏伐后不萌发直接死亡。部分病株桑叶枯萎症状始于桑树下部叶片，病叶从下而上出现枯黄并脱落现象。

1.2 桑细菌性枯萎病是由桑萎蔫病菌（Enterobac⁃ter mori）和劳尔氏菌（R.solanacearum）共同感染引起

1.2.1 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）是引起桑“枯萎”的主要病原之一

浙江大学生物技术研究所王国芬等［2］从一些发病严重的“枯萎”病树无法分离到桑青枯病菌，但同时分离获得500余株细菌菌株。经细菌学、生理生化、电镜观察、致病性及Kock氏法则测定、Biolog鉴定、脂肪酸分析及与8株标准参考菌株的比较结果，确证其为国内外尚未报道的桑树新病原，具有肠杆菌属（Enterobacter）细菌的特征。在分离菌株表型鉴定与致病性测定的基础上，浙江大学生物技术研究所朱勃等［3］通过ERIC-PCR分析及与10株参考菌株的比较、16S rRNA序列、rpoB基因分析及与Entero⁃bacter属中16个与植物和环境有关种的序列比较表明，桑萎蔫病原是由Enterobacter属1个以上的新种所引起。浙江大学生物技术研究所王国芬等［4］通过对引起“桑萎蔫”的4株菌株的Biolog、脂肪酸、16S rDNA和rpoB基因的研究，明确了该病原的特征及其多样性。浙江大学生物技术研究所朱勃等［5］通过对桑萎蔫病菌一系列的深入研究，包括对Enterobacter属内8个与植物有关的8个标准细菌种的分子杂交，明确了桑萎蔫病菌与国际上现有的细菌种有很大差异，将其种名定为Enterobacter mori，并得到国际认可。与此同时，浙江大学生物技术研究所朱勃等［6］深入开展桑萎蔫病菌致病基因研究，在国际上首次对引起桑萎蔫病菌的1株菌株作了全序列基因组测序。

1.2.2 劳尔氏菌（R.Solanacearum）也是引起桑“枯萎”的主要病原之一

吕志强、王汉荣、周勤等［1］对从临安、桐庐等地桑园中的“枯萎”桑树根、茎部获得151个细菌分离物样品。经离体水培接种试验、PCR鉴定，结合田间发生症状，诊断为细菌性青枯病，病原为劳尔氏菌（R.so⁃lanacearum）。从125个雷尔氏菌株中选择16个典型菌株进行研究，根据Hayward的生理小种划分标准，16个分离菌株属青枯菌生理小种1，其中75%为青枯菌的生化型V、25%为青枯菌的生化型Ⅲ。同时，从病原物分离菌株的PCR鉴定中，其中26个供试菌株没有扩增出与番茄青枯病菌阳性对照一致的条带，可能为一种新类型的致病菌。徐丽慧等［7］从桐庐和临安的桑枯萎样本中分离到病原细菌15株，经25项主要细菌学特性、菌落形态、致病性、Biolog、脂肪酸分析、RAPD-PCR鉴定及与4株标准菌株比较，证实了部分样本中存在劳尔氏菌（R.solanacearum），属于生化型Ⅴ和Ⅳ，它们在15株分离菌中分别占73.3%和26.7%。

1.3 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）与劳尔氏菌（R.solanacearum）的关系

桑细菌性枯萎病是由桑青枯病菌和桑萎蔫病菌侵染桑树维管束引起的病害，属于一种毁灭性的桑树细菌性病害。桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）引起的症状非常相似，均引起“枯萎”症状，这可能与这2种病原同时混合发生有一定关系。2株菌所引起的病害症状最大的差别是，Enterobacter mori引起的桑萎蔫，病叶容易脱落，病叶容易发黄（见图1）。这与Enterobacter mori菌分泌的毒素有关。而R.solanacearum菌引起的“枯萎”通常是青杆上绿叶被晒干的症状，病叶不太容易脱落和变黄（见图1）。2种病原菌的菌体和菌落形态相同之处是：桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）均为革兰氏阴性菌，菌体短杆状，能游动。在透射电子显微镜下观察，两者的差别在于：桑萎蔫病菌的个体略大于青枯病菌、周生鞭毛；青枯病菌个体略小，1～4根极生鞭毛（图2）。它们在KMB培养基上不产生荧光色素；不产生芽孢；兼性厌氧。在TTC鉴别培养基上菌落初为红白色，后呈半透明的深粉红色，外围的白色部分较小，菌落表现为：平滑，均匀，边缘清晰、规则，紫色到深紫色菌落，外围有一透明或半透明圈（图3）；而桑青枯病菌（R. solanacearum）的菌落在TTC培养基上则与上述特征完全不同，菌落白色，严格好氧，中间呈淡红色，边缘不规则，流动状。

表1 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）的主要差别Table 1The main differences between Enterobacter mori and R.solanacearum

图1 由Enterobacter mori引起的桑萎蔫病（左）和由R.solanacearum菌引起的桑青枯病（右）和田间症状Figure 1Field symptoms of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

图2 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）（左）和桑青枯病菌（R.solanacearum）（右）电镜下菌体形态Figure 2Electron microscopic morphology of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

图3 桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）（左）和桑青枯病菌（R.solanacearum）（右）在TTC培养基上菌落形态Figure 3Colony morphology on TTC medium of mulberry wilt caused by Enterobacter mori（left）and mulberry bacterial wilt caused by R.solanacearum（right）

2 检测技术

由于两种病原细菌的传播传染性强，桑青枯病菌为国内多省检疫性病害，而桑萎蔫病菌在国际上尚无检测方法。因此建立快速准确的检测方法是控制病原传播蔓延的有效手段之一。浙江大学生物研究所楼妙苗等［8］在国际上首次自行设计了桑萎蔫病菌Enterobacter mori的特异性引物，建立一种准确、快速、灵敏的病原实时定量PCR检测法（灵敏度10 fg/μl和102 CFU/ml）；对桑青枯病菌R.solanacearum在国内首次设计了检测桑青枯病菌的特异性引物，建立了简便易行的桑青枯病病原细菌测定新方法。

浙江大学生物研究所应用自行设计的2种特异性引物和检测技术，对田间采集样本进行了检测。结果显示：引起桑萎蔫病的Enterobacter mori菌和引起桑青枯病的R.solanacearum菌可同时存在于同一样本中，但也可单独存在。对桐庐、临安和淳安三地102份桑枯萎病样本进行检测。结果：2种菌同时存在的样本达到53%～65%，其中以桐庐县为最高；桑青枯病菌单独存在的样本占50%～55%左右，其中以淳安县为最高（淳安县为桑青枯病）；桑萎蔫病菌单独存在的样本占6%～15%，以桐庐县为最高。表明桑萎蔫病菌在大多数情况下与桑青枯病菌同时存在，而且发现两菌同时存在的情况下，病情相对较重。同时，对广东地区的8份样本桑树疑似桑青枯病害作了比较与分析。检测结果显示，桑青枯病在浙江和广东地区均较严重，而萎蔫病菌目前只在浙江发生，且在浙江临安和桐庐地区发病严重。

3 发病原因分析

通过对桐庐、临安和淳安等地发病桑园和病株调查，表明发病桑园除存在大量致病的桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）这个客观原因外，经过田间调查、品种抗性试验、土壤理化性状分析等表明，两种病害的发生和流行还主要与以下四个方面的原因相关。

3.1 种植的桑树品种抗性不强

目前，桐庐、临安和淳安三县（市）病区种植的主要桑品种为农桑14号、荷叶白、农桑12号、桐乡青、育711等我省现行主栽品种，其砧木为实生桑和两广杂交桑。经田间调查，各品种均有发生。

浙江省农科院植微所采用人工接种桑细菌性枯萎病菌（分离纯化自桐庐县的桑细菌性枯萎病株）。人工接种的菌液浓度为106～107个细菌/m1。接种方法采用断根接种法，即用刀片将准备好的桑幼苗根部分切伤，每株灌注250 m1的细菌悬浮液。接种后每7 d调查1次，观察28 d，最后计算累加发病株率或病情指数。病情调查分级标准：0级：无症状；1级：1片叶萎蔫；2级：2～3片叶萎蔫；3级：除顶部2～3片叶外，其他叶片萎蔫；4级：整株叶片萎蔫。

经人工接种鉴定强桑1号、农桑14号、金10、丰田5号、抗青10号、苏北实生苗（CK）表明，抗青10号对桑细菌性枯萎病菌的抗性较好，其次为金10，其他桑树品种对桑细菌性枯萎病菌的抗性均较差，结果见表2。

同时，经对我省杂交苗产地萧山海涂苗区调查，从1997年开始从广东大量引进对桑青枯病易感的杂交桑品种塘10×伦109［9］进行繁育，出售给桐乡和海宁嫁接苗产区用作嫁接苗的砧木。2000年前后随着粮食购销市场化改革，临安和桐庐2县（市）开始大量种植桑树。而从2001年和2002年即开始发病。因此，该病的发生与砧木品种塘10×伦109具有一定的相关性。

表2 不同桑品种抗细菌性枯萎病人工接种鉴定结果Table 2The evaluation results of artificial inoculation of anti-bacterial wilt among different varieties of mulberry

表3 临安市和桐庐县桑细菌性枯萎病发病桑园土壤情况调查Table 3The investigation of soil conditions in the mulberry orchards effected by bacterial wilt in Linan city and Tonglu county

3.2 适温高湿环境条件有利于发病

桑青枯病菌在10～40℃的范围内均可生长，以28～36℃生长最好，18℃以下、36℃以上生长受到抑制。因此，桑细菌性枯萎病容易在5～10月发生。种植的易感品种零星发病后，遇暴雨洪涝灾害，病菌随之扩散。分布在临安市昌化溪、天目溪和桐庐县分水江两岸的桑园地势低洼，容易遭受水淹。再遭遇间隙性雷阵雨天气，有利于细菌的繁殖和侵染，同时桑树叶片蒸腾作用加大，容易出现桑细菌性枯萎病大暴发。据桐庐县气象局提供的资料，2006年5月受北方冷空气和第1号台风环流的影响，出现了2次暴雨天气，雨量偏多，月雨量达274.6 mm，较历年偏多64%，雨量之多为历史第三位。6月平均气温为25.8℃，较历年偏高1.2℃，虽然梅雨量少，但各旬雨量分布较为均匀，由于前期雨量较多，没有出现旱情。7月平均气温为29.9℃，较历年偏高1.4℃，月雨量104.1 mm，较历年偏少29%，月雨日14 d，较历年偏多1 d，各旬分布均匀。8月平均气温为29.7℃，较历年偏高1.8℃，气温之高为历史第二位，雷暴天气较多，达15 d，较历年偏多5 d。因此，偏多的降水和间隙性雷阵雨天气，成为2006年桑细菌性枯萎病大暴发之年。

3.3 桑园农事操作加剧传播

桑苗种植后，夏季生长发育快，蒸腾作用强，但由于根部伤口较多，病菌极易侵入繁殖堵塞维管束，造成新种桑种植当年即可发病死亡。成林桑于5月下旬夏伐后，桑树树势下降，大量的毛细根脱落死亡，根部形成伤口，病菌容易侵入。成林桑受到病害侵染后，可使桑树部分枝条出现症状或生长势下降，桑园中出现发病中心，第2年逐步扩展至全株发病并蔓延。同时，桑树发病后，可通过夏伐用的桑剪、锄头等工具可传播给其他桑树，严重的夏伐后不萌发直接死亡；灌溉用水经过发病桑园造成水平传播。

3.4 砂性土壤和土壤酸化有利于发病

土壤砂性重、通透性好，有利细菌的繁殖。同时，长期偏施化肥导致土壤酸化，有利于本病的发生。临安市农技推广中心于2011年对9个发生桑青枯病的村进行土壤调查，结果发病桑园属砂壤土和砂土，PH值平均4.4；桐庐县农技推广中心对发生桑细菌性枯萎病的12个村进行土壤调查，结果桑园土壤性质属壤土、砂土、砂壤土，土壤PH值平均6.1。2地共调查发病桑园239.2 hm2，占发病桑园的71.2%，土壤质地为砂壤土、砂土、壤土，pH值平均5.3（具体汇总数据见表3），其中属砂壤土、砂土的面积162.32 hm2，占调查面积的67.8%。土壤调查表明，临安市桑园土壤砂性重、土壤酸化严重；田间发生情况也表明，临安市比桐庐县发病面积广，桐庐县桑园发病重。

4 讨论

通过多年的深入调查研究，探明了发生在浙江省临安市和桐庐县的桑“枯萎”是由“桑萎蔫病菌（En⁃terobacter mori）和桑青枯病菌（R.solanacearum）”引起，其中桑萎蔫病菌（Enterobacter mori）是国际上首次发现的一种新病原。由于桑萎蔫病和桑青枯病是传播性、毁灭性病害，要有效控制病害的发生，需在明确病原种类、发病原因的基础上，从抗病品种、防治药剂、桑树管理技术、土壤改良等多方面入手，形成全方位的防控技术体系。

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The Diagnosis and Analysis of the Wilt of Mulberry’s Diseases Causes

ZHOU Qin1,WANG Han-rong2,XIE Guan-lin3,LV Zhi-qiang4, YE Wei-qing5,MEI Hong-fei6,LIN Bao-yi1
（1.Zhejiang Provincial Bureau of Crop Farming,Hangzhou 310020,China; 2.The Plant Protection and Micro-organism Research Institute of Zhejiang Agricultural Science Academy,Hangzhou 310020,China; 3.The Bio-technology Research Institute of Zhejiang University,Hangzhou 310020,China; 4.The Silkworm and Mulberry Research Institute of Zhejiang Agricultural Science Academy,Hangzhou 310020,China; 5.The Agricultural Technology Extension Center of Tonglu County,Hangzhou 311501,China; 6.The Agricultural Technology Extension Center of Lin'an,Hangzhou 311300,China）

The article introduced the symptoms of wilt diseases of mulberry,as well as the study and detecting techniques of Enterobacter mori and R.solanacearum causing the diseases in Lin'an city,Tonglu county and Chun'an county in Zhejiang province systematically.Through abundant investigations,it analyzed the main causes of the outbreak of the disease systematically,mainly caused by low resistance of mulberry varieties,environmental conditions of eligible temperature and high humidity,cultivations of mulberry orchards,and the sandy and acidic soil etc.

wilt of mulberry;diagnosis of disease;analysis of disease causes;Zhejiang Province

S888.7

A

0258-4069［2016］04-012-06

周勤（1965-），女，浙江海宁人，推广研究员，主要从事花卉、蚕桑技术推广和行业管理。E-mail：zhq20039@163.com