芽孢杆菌L15菌株发酵培养条件的优化

张东升，王震，毛东东，冀婷婷，李华

（大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023）



芽孢杆菌L15菌株发酵培养条件的优化

张东升，王震，毛东东，冀婷婷，李华

（大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023）

摘要：芽孢杆菌L15菌株能有效降低刺参Apostichopus japonicas养殖水中的化学耗氧量 （COD）和氨氮（NH+4-N）含量，促进刺参生长，为大量发酵培养L15菌株并降低培养成本，以豆粕、麦麸、玉米酒糟、棉籽粕为碳、氮源，对发酵培养L15菌株的最佳碳、氮源及其配比和最佳发酵条件 （如装液量、接种量、转速等）进行了初步优化研究。结果表明：培养芽胞杆菌L15菌株的最佳碳、氮源为麦麸和豆粕，最佳添加量分别为3、2 g/L；最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min；在最佳培养基和最适培养条件下，发酵培养的L15菌株细菌数量可达1011cfu/mL，与用2216E培养基培养的L15菌株相比，在实验室条件下，对海参底泥COD的去除率虽无明显变化，但培养成本却降低了91%。研究表明，用豆泊和麦麸作为培养基培养L15菌株具有可行性，不仅细菌数量达标，且培养成本显著降低。

关键词：刺参；芽孢杆菌L15菌株；发酵培养；正交试验

刺参Apostichopus japonicas已成为中国北方最重要的海水养殖种类，2013年养殖面积达22万hm2，年产量约19万t［1］。然而，随着刺参养殖时间的延长，每年春、夏季池塘会产生大量的丝状藻类，这些藻类死亡后造成池塘底部缺氧，有毒有害物质如硫化氢 （H2S）、氨氮 （NH+4-N）等大量产生，致使刺参吐肠和死亡。化学除草剂的使用能非常有效地抑制这些藻类的生长繁殖，但长期应用这些化学药物，不仅破坏了养殖池塘固有的微生态平衡［2-3］，而且药物残留影响刺参品质。因此，绿色生态养殖是刺参养殖的最佳方式。

目前，微生态制剂的使用是快速去除底泥有机物、改善养殖环境、抑制大型藻类生长的绿色生态养殖方式之一。以刺参为研究对象的细菌微生态制剂包括光合细菌［4］、硝化细菌［5］、EM 菌［6-7］、枯草芽孢杆菌［8］和蛭弧菌［9］，具有提高刺参养殖池塘溶氧 （DO），降解NH+4-N、亚硝酸氮 （NO-2-N）、化学耗氧量 （COD）和破坏病害细菌的作用，但在去除底泥有机污染物方面效果不佳。2001年，李秋芬等［10］分离出能够高效降解虾池饵料的益生菌 （坚强芽孢杆菌Bacillus firmus Lt7222、枯草芽孢杆菌 B.subtilisGy7018 和环状芽孢杆菌B.circulans Lt7511），这些菌对虾池底泥有机质去除率达43.52%。虾池底泥与刺参养殖池底泥有机化学组成不同，分离高效降解刺参池塘底泥有机物的益生菌，是从根本上改善刺参池塘养殖环境、提高刺参品质的有效举措［11］。目前，除闫法军等［12］报道了从刺参池塘中分离筛选有机污染物降解菌外，尚无其他报道。

作者曾经从大连市某刺参养殖池塘中分离筛选出一株降解刺参养殖池塘有机质的益生芽孢杆菌L15菌株，该菌可有效降低刺参养殖池中的COD 和NH+4-N含量，显著促进刺参生长，经鉴定与印度芽孢杆菌Bacillus indicus具有99%的相似性［13］，为大量发酵培养该菌株，并用于刺参池塘底泥的生物修复，本研究中对其发酵培养条件进行了初步优化研究，旨在为刺参的绿色生态养殖提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

芽孢杆菌L15菌株由大连海洋大学水产与生命学院实验教学中心自行分离保存。

麦麸、豆粕、玉米酒精糟、棉籽粕购自大连市

1.2方法

1.2.1菌种培养 取4℃下冷藏斜面保存的L15菌株，接种于2216E液体培养基中，并置于25℃恒温震荡培养箱里活化12 h，按1%接种量转接液体培养基中培养12 h，待用。

1.2.2最佳碳、氮源的筛选和使用量的确定

（1）最佳碳、氮源筛选。配制含有0.01 g/L FePO4的陈海水，取10 mL置于50 mL大试管中，每5管为一组，每管按5 g/L分别加入麦麸、玉米酒精糟、豆粕、棉籽粕各0.05 g，或两两组合各加入0.025 g，调节pH为7.0～7.5，121℃下灭菌20 min，置于冰箱 （4℃）中保存待用。

（2）接种。每组取3只试管作为试验组，每管接种培养12 h的细菌悬液0.1 mL，另2只试管作为对照组，不接种。将试验组和对照组全部放入30℃的恒温振荡培养箱中 （转速150 r/min）培养24 h后取出，用721分光光度计测定吸光度 （波长为600 nm、宽为1 cm的玻璃比色皿），以试验组吸光度与对照组吸光度的差，表示L15菌株的生长情况。

（3）最佳碳、氮源用量的确定。对筛选出的最佳碳、氮源，分别以1、2、3、4 g/L的浓度按L16（42）正交试验设计添加到含有0.01 g/L FePO4的陈海水中进行试验，培养基配制、细菌接种及培养和生长测量方法同上，根据正交试验结果分析确定碳、氮源的最佳用量。

1.2.3L15菌株摇床发酵培养条件的正交试验

以上述筛选的最佳碳、氮源和含有0.01 g/L FePO4的陈海水为培养基，筛选L15菌株的最佳发酵培养条件。培养条件设装液量、接种量、转速3个因素，每个因素设3个水平 （表1），进行L9（34）正交试验。根据正交试验设计，将不同体积培养基装于250 mL的三角烧瓶内，灭菌方法同上；然后按正交试验设计接种L15菌株到上述三角瓶内，放入震荡频率不同的培养箱中，培养温度均为30℃，培养24 h后，测定其吸光度，根据结果进行方差分析，得到最佳培养条件。

1.2.4最佳培养条件的验证

（1）细菌数量的测定。采用最佳发酵培养条件培养L15菌株48 h，按常规平板涂布法在2216E培养基上进行计数。

表1　发酵培养条件的正交试验因素及水平Tab.1 Factors and levels of fermentation culture conditions in an orthogonal test

（2）对有机物质COD去除效果的测定。使用最佳发酵培养基和2216E培养基，在最佳发酵培养条件下培养L15菌株12 h。称2 g刺参池塘风干底泥放入装有100 mL陈海水的250 mL三角烧瓶中，调节pH为7.0～7.5，121℃下灭菌30 min，按1%接菌量分别接种至两种培养基中，各3瓶，于25℃下培养3 d，取适量，以4500 r/min离心10 min，采用高锰酸钾法［14］测定上清液中的COD含量。

COD去除率=（接种前培养基上清液中COD含量-接种培养后上清液中COD含量）/接种前上清液COD含量×100%。

1.3数据处理

利用SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析，用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

2　结果与分析

2.1L15菌株最佳碳、氮源及其最佳用量

通过含有单一碳源或氮源培养基以及碳、氮源等比组合培养基培养L15菌株。结果表明，在豆粕与麦麸等比组合培养基培养下，L15菌株生长量最高，豆粕组次之，二者均显著高于其他组 （P＜0.05），即豆粕与麦麸组合为发酵培养L15菌株生长的最佳碳、氮源 （表2）。

最佳碳、氮源的最佳用量确定：根据确定的最佳碳、氮源，设定碳、氮源取值范围为1、2、3、4 g/L，以豆粕和麦麸为基础培养基，利用L16（42）正交试验测定豆粕与麦麸不同浓度组合对L15菌株生长的影响。从表3可见，7号试验组L15菌株生长效果最好，即豆粕2 g/L和麦麸3 g/L时，组菌生长量最多。从表3还可见：随着豆粕用量的增加，L15菌株生长呈增加趋势，但用量为2、3、4 g/L时，L15菌株生长无显著性差异 （P＞0.05），极差仅为0.011，但均显著高于用量为1 g/L时L15菌株的生长 （P＜0.05），说明豆粕用量为2 g/L时就已满足了L15菌株生长要求；随着麦麸用量的增加，L15菌株生长也呈增加趋势，麦麸用量为3、4 g/L时，L15菌株生长显著高于用量为1、2 g/L时 （P＜0.05），但用量为3、4 g/L时L15菌株生长量极差较小，仅为0.001，且无显著性差异（P＞0.05），说明麦麸用量为3 g/L时，就已满足了L15菌株的生长要求。可见，豆粕和麦麸用量分别为2、3 g/L组合时，L15菌株生长最好，这与正交试验结果一致 （表3），此时L15菌株数量最多，可达109cfu/mL。

表2　不同碳、氮源对L15菌株生长的影响Tab.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on L15 strain growth

2.2L15菌株的最佳发酵培养条件

以最佳碳、氮源配比为培养基，由L9（34）正交试验结果和方差分析 （表4）可知，随装液量的增加，L15菌株生长呈下降趋势，装液量为1/3时，L15菌株生长最好，与装液量为2/3时有显著性差异 （P＜0.05）；随接种量的增加，L15菌株生长呈下降趋势，接种量为1%时，L15菌株生长最好，但与接种量为2%、4%时无显著性差异 （P＞0.05）；转速为160 r/min时，L15菌株生长最好，与转速为140 r/min、180 r/min时有显著性差异（P＜0.05），可见，L15菌株的最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min。使用最佳发酵条件培养L15菌株48 h，L15菌株生长量可达1011cfu/mL。

用2216E和本试验中所得最佳培养基培养L15菌株24 h，两者对海参底泥有机质COD的降解率无显著性差异 （P＞0.05）（表5），用2216E培养基培养的L15菌株对海参底泥有机质96 h降解率为38.30%，用豆粕+麦麸培养基培养的L15菌株降解率为39.99%，说明本试验中所得最佳发酵培养基培养的L15菌株对COD降解效果略有提高。

表3　不同用量豆粕、麦麸培养L15菌株的正交试验设计及结果Tab.3 Design and results in the orthogonal test under different dosages of soybean meal and wheat bran

3　讨论

印度芽孢杆菌最早被发现于印度孟加拉一受砷污染的淡水水域［15］，它对重金属具有抗性。2009年首次发现印度芽孢杆菌存在于海水中［16-17］。Hong等［18］报道，可以将印度芽孢杆菌安全地用作食品添加剂；英国人从人体中分离出一株印度芽孢杆菌，发现其菌株体内含有特殊类胡萝卜素，虽不能被胃酸分解，但人和动物摄食后，能够提高其免疫力，已将其申请为生产特殊类胡萝卜素的专利菌株。

表4　不同发酵条件培养L15菌株的正交试验设计及结果Tab.4 Design and results in the orthogonal test of different fermentation conditions

表5　两种培养基培养的L15菌株对刺参池塘底泥COD的去除率Tab.5 Removal rate of pond sediment COD by L15 strain cultivated in two culture media

尽管L15菌株与印度芽孢杆菌具有99%的相似性，且在糖的利用和发酵效果上也完全一致，但至今尚无印度芽孢杆菌大规模培养的文献和专利资料，且同一种菌存在的地理和环境差异性，为进一步研究该菌株对海参养殖池塘底泥及水质原位修复效果，需大量培养该菌株。目前，实验室培养该细菌使用的是2216E培养基，其成本较高，为降低成本，需筛选物美价廉的原料作为培养基。而培养细菌最基本的营养成分为碳、氮源［19］，但每种细菌生长所需最佳碳、氮源的种类和比例不同，如蜡质芽孢杆菌需要的最佳碳、氮源为玉米粉和黄豆粉，分别占培养基含量的0.5%［20］；枯草芽孢杆菌的最佳碳、氮源为麸皮、稻壳、玉米粉、豆粕，分别占培养基的80%、10%、5%、5%［21］，这与不同细菌分泌水解酶种类以及细胞化学组成不同有关。本研究中选择了棉籽粕、豆粕、玉米酒精糟、麦麸作为碳、氮源，根据培养基配制及不影响L15菌株使用的原则，筛选出发酵培养L15菌株的最佳碳、氮源为麦麸与豆粕，最佳含量分别为3、2 g/L。试验证明，在含有最佳碳、氮源配比下的海水培养基中，L15菌株生长最好，培养的细菌数量与用2216E培养基培养的相同，培养成本却降低了91%。

为获得更高的菌株产量，需要筛选最佳发酵条件，发酵条件一般包括发酵液初始pH、培养温度、装液量、接种量、转速等。不同细菌因生理不同，所需发酵条件也不同，如蜡质芽孢杆菌Bacillus cereus最佳发酵条件为装液量1/5、接种量5%、发酵温度28℃和转速200 r/min［19］，而解磷巨大芽孢杆菌 B.megaterium的最佳发酵条件为温度30℃、起始pH 8.0、装液量20 mL/250 mL三角瓶、接种量3%、摇床转速250 r/min［22］，装液量和转速都影响培养液的氧含量，接种量过大会带进前期培养液废物，接种量过小细菌生长速度减慢。本研究中根据前期试验结果，确定了发酵培养L15菌株的最适发酵pH（7.0～7.5）和温度 （30℃），仅对L15菌株发酵培养中的装液量、接种量、转速3个条件进行了正交试验。依据文献资料［19，22］，选用装液量、接种量、转速作为筛选发酵条件的指标，得出L15菌株的最佳发酵培养条件为装液量1/3、接种量1%、转速160 r/min。在最佳碳 （麦麸3 g/L）、氮源 （豆粕2 g/L）和最佳发酵培养条件下，L15菌株细菌数量可达1011cfu/mL，且发酵培养的L15细菌与用2216E培养基培养的L15细菌相比对刺参底泥COD的去除效果略高。

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中图分类号：S949

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.006

文章编号：2095-1388（2016）03-0261-05

收稿日期：2015-09-05

基金项目：国家农业科技成果转化项目 （2014GB2B000366）；辽宁省渔业厅重点攻关项目 （201402）

作者简介：张东升 （1963—），女，教授。E-mail：zhangdongsheng@dlou.edu.cn

通信作者：李华 （1958—），女，博士，教授。E-mail：lihua@dlou.edu.cn开发区某饲料厂，培养基的其他成分为化学分析纯试剂。

Optimization of fermentation and culture conditions of Bacillus L15 strain

ZHANG Dong-sheng，WANG Zhen，MAO Dong-dong，JI Ting-ting，LI Hua
（Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：Bacillus strain L15 was isolated from sea cucumber Apostichopus japonicas culture ponds in Dalian and found to be effectively reduced levels of COD and NH+4-N in the sea cucumber ponds and significantly promoted the growth of sea cucmber.The strain L15 was cultured in media of soybean meal，wheat bran，corn distillers，cottonseed meal to optimize carbon and nitrogen sources and fermentation conditions including loading volume，inoculation quantity，and rotational speed in order to reduce cost in mass fermentation cultivation of L15 strain.The results showed that the best fermentation culture of L15 strain was observed under conditions of soybean meal and wheat bran as carbon（3 g/L）and nitrogen（2 g/L）sources，1/3 loading volume，1%inoculation quantity，and rotational speed of 160 r/min，with density of 1011cfu/mL，and without significant difference in degradation rate of COD in the sea cucumber pond sediments by the cultivated L15 strain compared with 2216E medium cultivation of L15 strain under the condition of indoor experiments.However，the cultivation cost was found to be decreased by 91%，indicating that it is feasible to cultivate L15 strain for use of beans and wheat bran to meet bacterial number requirement.

Key words：Apostichopus japonicus；Bacillus L15 strain；fermentation cultivation；orthogonal experiment