广西地不容内生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

卿 朕，周秋艳，孙文斌，骆海玉，戴梅清，邓业成

(广西师范大学 生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林 541004)

广西地不容内生真菌疣孢漆斑菌DBR-11的抑菌活性

卿 朕，周秋艳，孙文斌，骆海玉，戴梅清，邓业成*

(广西师范大学 生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室，广西 桂林 541004)

为了研究广西地不容内生真菌的抑菌活性，从广西地不容块根中分离纯化出18株内生真菌，采用拮抗试验测定了其对10种植物病原真菌的抑制活性，发现疣孢漆斑菌DBR-11对多数供试菌有很好的抑制活性。进一步测定了DBR-11菌株发酵产物的抑菌活性，发现发酵产物的乙酸乙酯萃取物对病原菌的抑制活性较高，质量浓度为5 g/L时，对10种植物病原真菌的抑菌率均在90%以上，有效中浓度(EC50)为0.007 2～0.446 5 g/L，其中对烟草黑胫病菌的毒力最高,EC50值为0.007 2 g/L；发酵产物的乙酸乙酯萃取物质量浓度为2 g/L时，72 h对15种供试动物病原菌中的7种能完全抑制，最低抑制浓度(MIC)为0.062 5～0.25 g/L，其中对痢疾志贺氏菌的抑制活性最高,MIC值为0.062 5 g/L。DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物有广谱的抗菌活性，具有潜在的应用价值。

广西地不容； 内生真菌； 疣孢漆斑菌； 抑菌活性； 发酵产物

广西地不容(StephaniakwangsiensisLo.)为防己科千金藤属植物，主产于广西西北部至西南部，生于山地灌丛的石灰岩地区[1]。目前多数文献都是对广西地不容生物碱的研究[2]，也有一部分研究它的其他药理性质，如抑菌活性[3]、杀虫活性[4]等。近年来，由于药用植物过度使用，使得许多药用植物濒临灭绝。为了解决资源短缺问题，药用植物内生菌成为药用植物新资源研究的一个热点[5]。植物内生菌(endophtic)是指生活在健康的植物组织和器官内部的真菌或细菌，是与宿主植物在长期的共同进化过程中衍生的一类微生物[6]。植物内生真菌在植物微生态系统中长期与宿主建立了和谐的联合关系，不但能够产生与其宿主相同或者相似的活性物质，而且其次生代谢产物十分丰富[7]，从而可以用于多种生理活性研究，如抗肿瘤、抗菌、杀虫和免疫抑制等活性[6,8]。疣孢漆斑菌属壳霉目杯霉科，对菌株疣孢漆斑菌的研究包括产酶[9-10]、杀虫[11]等方面。目前，国内外有关植物内生真菌抑菌活性的研究虽然较多,但有关广西地不容内生真菌以及疣孢漆斑菌代谢物抑菌活性的研究尚未见报道。本研究对广西地不容块根中内生真菌进行分离、活性筛选和鉴定,并对疣孢漆斑菌DBR-11进行发酵培养,对其发酵产物各萃取相进行抑菌活性测定，以期为DBR-11 菌株的进一步开发利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物内生真菌 供试的18个植物内生真菌菌株从采自广西植物研究所的广西地不容块根中分离获得[12-14]，采用形态学和分子生物学(ITS序列分析)技术相结合的方法鉴定DBR-11菌株为疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)。

1.1.2 供试植物病原真菌 包括玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)、烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasitica)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、甘蓝黑斑病菌(Alternariaoleracea)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、茶轮斑病菌(Pestalotiopsistheae)、贡柑链格孢菌(Alternariacitri)、水稻胡麻叶斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)10种，除金橘砂皮病菌和贡柑链格孢菌由广西特色作物研究所提供以外，其余8种均由广西大学农学院植物病理室提供。

1.1.3 供试动物病原菌 包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、普通变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、乙型副伤寒杆菌(BacteriumparatyphosumB)、炭疽杆菌(Bacillusanthraci)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)15种，由桂林医学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌发酵 挑取保存的纯化菌种接种于PDA平板上，待活化后，用0.4 cm打孔器在菌落平板上打取菌饼，用镊子挑取1个菌饼，接种于装有400 mL灭菌液体PDA的1 000 mL锥形瓶中，置于恒温培养箱中(27±1)℃培养，每天摇晃2～3次，培养30 d。

1.2.2 内生真菌发酵产物粗提物的制备及初步分离 将内生真菌发酵产物用无水乙醇按1∶1比例浸泡3 d[13]，再用2层纱布过滤，过滤得到的发酵产物进一步抽滤后用旋转蒸发器减压浓缩，得发酵浓缩液。用液-液萃取法分离内生真菌粗提物，把发酵浓缩液置于分液漏斗中，依次用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3～5次，合并萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及萃余物。

1.2.3 抑菌活性测定

1.2.3.1 植物内生真菌对植物病原真菌的拮抗试验 采用平板对峙法[15-16]，预先在培养皿底面用记号笔做记号，记号点以培养皿中心轴对称，两点间距3 cm。将直径为0.4 cm的打孔器灭菌后，在培养5 d的内生真菌和病原菌的菌落边缘打出菌饼，然后在无菌条件下取菌饼接种在平板培养基的标记点上，于28 ℃恒温箱中培养5 d后观察。依据对峙菌落之间有无抑菌带来确定它们之间是否有拮抗作用。用尺子量取其抑菌带宽度(单位为mm)，每个皿测量3个点，取其平均值作为评判抑菌效果大小的依据。每组处理3个重复，取其平均值记录。

1.2.3.2 发酵产物对植物病原真菌菌丝生长的抑制活性测定 采用菌丝生长速率法[17]测定。首先把样品配成质量浓度为50 g/L的药液，溶剂为丙酮或者丙酮和水(1∶1)。在无菌洁净工作台中，把1 mL药液(对照组用溶样溶剂代替)与9 mL热熔培养基混合均匀，倒入直径为9 cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基(5 g/L)。在已活化的供试菌落边缘，用直径为0.4 cm的无菌打孔器切取菌饼，并使菌丝面朝下接于带药培养基上，每个培养皿接3个菌饼成“品”字形分布，每个处理设3个重复。置于(27±1)℃光照培养箱中培养72 h后，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑制率：

抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.4)×100%。

测定有效中浓度(EC50)时，配制7个系列质量浓度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的带药培养基，测定各个质量浓度的抑菌率，用最小二乘法求出毒力回归方程、相关系数(r)、EC50及EC50的95%置信限和相对毒力。

1.2.3.3 发酵产物对动物病原菌的抑制活性测定 采用带毒平板法[18]。将菌种接到液体牛肉膏蛋白胨培养基中，置于(37±1)℃的水浴恒温振荡器中培养12～14 h进行活化。把样品配成质量浓度为20 g/L的药液，溶剂为丙酮或丙酮和水(1∶1)。在无菌洁净工作台中，将1 mL药液与9 mL热熔牛肉膏蛋白胨琼脂培养基混合均匀，制成厚薄均匀的带药培养基。将已活化的菌种摇匀，吸取0.1 mL于9.9 mL无菌水中稀释成菌悬液。吸取0.1 mL菌悬液，加到带药培养基上，涂布均匀。每个处理设3个重复。阳性对照组用溶样溶剂代替药液，其他条件不变，用于观察细菌能否正常生长。阴性对照则涂0.1 mL无菌水，其他条件不变，用于观察培养基、药液或无菌水是否污染。(37±1)℃条件下培养72 h后观察并记录结果。

测定样品对病原菌24 h的最低抑制浓度(MIC)时，采用常量肉汤稀释法。将已活化的菌种摇匀，吸取0.1 mL于9.9 mL液体培养基中稀释成菌悬液。再将样品配成系列质量浓度的药液，取0.1 mL与0.9 mL菌悬液混合于10 mL的无菌试管中，制成系列质量浓度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g/L)的含菌带毒培养液。每个处理设3个重复。阳性对照组用溶样溶剂代替药液，其他条件不变，用于观察细菌能否正常生长。阴性对照则为液体培养基，其他条件不变，用于观察培养基是否污染。(37±1)℃条件下培养24 h后，观察并记录结果，以不长菌的最低浓度作为样品对动物病原菌的MIC值。

2 结果与分析

2.1 18株广西地不容内生真菌对植物病原真菌的抑制活性

试验结果显示(表1)，18株广西地不容内生真菌对植物病原真菌的抑制效果不尽相同，DBR-11对玉米小斑病菌、金橘砂皮病菌、辣椒炭疽病菌有极强的抑制效果，对玉米大斑病菌、水稻胡麻叶斑病菌、甘蔗凤梨病菌和茶轮斑病菌有强的抑制效果。DBR-5、DRB-6、DRB-14和DRB-18只对10种植物病原真菌中的1种抑制效果强。而DBR-3、DRB-7、 DRB-8、 DRB-10、DRB-12、DRB-15和DRB-23对10种病原真菌都没有抑制效果。其余的内生菌仅对少数病原真菌有较强抑制效果或者有抑制效果。

注：根据抑菌带宽度(T)评判抑菌活性，并分为5个级别：“—”代表无抑菌活性，菌丝交叉，T=0；“+”表示有抑菌活性，0 mm

2.2 DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

采用菌丝生长速率法测定DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物在质量浓度为5 g/L 时对10种植物病原真菌菌丝生长的72 h抑制活性，结果见表2。由表2可知，乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好，对10种植物病原真菌的抑制率均达到90%以上，对其中8种病原真菌的抑制率达到100%。正丁醇萃取物也有较好的抑菌活性，对3种植物病原真菌的抑制率达到80%以上，对其余病原真菌的抑制率为40.40%～65.74%。萃余物基本没有抑菌活性。由此可知，活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

表2 DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物对10种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性

注：同列数据后字母相同者表示在5%水平上差异不显著(DMRT法)。

2.3 DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力

为进一步明确 DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物的抑菌效果，测定了乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力，结果见表3。由表3可知，DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对烟草黑胫病菌的毒力最高，EC50为0.007 2 g/L，对甘蓝黑斑病菌的毒力最低，EC50为 0.446 5 g/L，最大毒力是最小毒力的62.01倍，对其余8种植物病原真菌的EC50值为0.038 2～0.228 5 g/L。

表3 DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌菌丝的毒力

注：具有最大EC50值样品的相对毒力为1.00，其他各样品的相对毒力用最大EC50值除以该样品的EC50值而得。

2.4 DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物对15种动物病原菌的抑制活性

用带毒平板法测定DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物对15种动物病原菌的72 h抑制活性，结果见表4。由表4可知，当萃取物质量浓度为2 g/L时，DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对7种供试动物病原菌有抑制活性，并且对革兰氏阳性菌的抑制活性较革兰氏阴性菌好。DBR-11发酵产物正丁醇萃取物和萃余物对15种供试动物病原菌均无抑制活性。以上结果表明，DBR-11发酵产物对动物病原菌的抑菌物质也主要存在于乙酸乙酯萃取物中。

2.5 DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对7种动物病原菌的最低抑制浓度

根据表4的结果，将 DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物配成系列质量浓度梯度，并制成含菌带毒培养液，测定其对7种动物病原菌的24 h最低抑制浓度，结果见表5。由表5可知，DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物对痢疾志贺氏菌的抑制活性最高，MIC值为0.062 5 g/L，对其余6种动物病原菌的MIC值为0.125～0.25 g/L。

表4 DBR-11发酵产物不同溶剂萃取物对15种供试动物病原菌的抑制活性

注：“+”表示有菌生长，“—”表示无菌生长，下同。

表5 DBR-11 乙酸乙酯萃取物对7种供试动物病原菌的最低抑制浓度

3 结论与讨论

在拮抗试验中疣孢漆斑菌DBR-11对多数供试植物病原真菌有很好的抑制活性。该试验采取了平板对峙法，初步、定性判断菌株是否对供试菌有抑菌活性，可减少不必要的工作量，节约试验时间。拮抗试验中没有抑制效果的菌株并非说明其不能产生抑菌物质，可能是5 d的时间太短而不能产生抑菌物质或者所使用的平板对峙法阻碍了抑菌物质的扩散，所以还可以用内生菌发酵产物对病原菌进行生长抑制试验，进一步确认和筛选抑菌优良菌株。

有研究结果[13,19-20]显示，内生菌发酵产物的乙酸乙酯萃取物有广泛的抑菌活性，本试验也表明，疣孢漆斑菌DBR-11乙酸乙酯萃取物有较强的抑菌活性，在5 g/L的质量浓度下，其对10种植物病原菌的72 h抑制率均在90%以上，对烟草黑胫病菌的毒力最高，EC50为0.007 2 g/L；在2 g/L的质量浓度下，其对15种动物病原菌中的7种具有72 h的完全抑制能力，对痢疾志贺氏菌抑制效果最好，24 h最低抑制浓度为0.062 5 g/L。DBR-11发酵产物乙酸乙酯萃取物有广谱的抗菌活性，具有潜在的应用价值，可以进一步研究其中活性物质的组分和单体结构，探究其与广西地不容抗菌成分的关系。

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Antimicrobial Activity of Endophytic FungusMyrotheciumverrucariaDBR-11 fromStephaniakwangsiensis

QING Zhen,ZHOU Qiuyan,SUN Wenbin,LUO Haiyu,DAI Meiqing，DENG Yecheng*

(College of Life Science,Guangxi Normal University/Key Laboratory of Ecology and Environmental Protection of Rare and Endangered Species，Ministry of Education of China,Guilin 541004,China)

To study the antimicrobial activity of endophytic fungi fromStephaniakwangsiensis,eighteen strains of endophytic fungi were isolated from the earthnuts ofStephaniakwangsiensis.Antagonism test was used for determining the inhibitory activity of the endophytic fungi against 10 plant pathogenic fungi.The results showed thatMyrotheciumverrucariaDBR-11 had good inhibitory activities against most tested pathogens.By further determining the antimicrobial activity of DBR-11 fermentation product,it found that ethyl acetate extract from its fermentation product had high inhibitory activity against the tested pathogentic microbes.The inhibition rates against 10 kinds of plant pathogenic fungi were more than 90% when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 5 g/L,with EC50value from 0.007 2 to 0.446 5 g/L,and it had highest virulence againstPhytophthoraparasiticawith the EC50value of 0.007 2 g/L.While there was a utterly inhibitory activity against seven species among fifteen animal pathogenic bacteria when the concentration of ethyl acetate extract of fermentation product was 2 g/L after 72 h observation,with the MIC values of 0.062 5—0.25 g/L,and it showed the best inhibitory activity againstShigelladysenteriaewith the MIC value of 0.062 5 g/L.The ethyl acetate extract of DBR-11 fermentation product has a broad spectrum of antimicrobial activity,with potential applications.

Stephaniakwangsiensis； endophytic fungi；Myrotheciumverrucaria； antimicrobial activity; fermentation product

2015-10-28

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA019058)；广西高校科研资助项目(2013YB037)

卿 朕(1988-)，男，广西桂林人，在读硕士研究生，研究方向：天然产物。E-mail：491520293@qq.com

*通讯作者：邓业成(1965-)，男，广西全州人，教授，博士，主要从事天然产物及植物保护等研究工作。 E-mail:dyecheng@163.com

S476;S482.2+92

A

1004-3268(2016)05-0077-06