罗非鱼腐皮病病原菌分离鉴定及其对中草药敏感性试验

高桂生，张艳英，高光平，史秋梅*，李星灿，韩红升，黄晓媛，缴宝丰，宋青春

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛066600； 2.秦皇岛粮丰海洋生态科技股份有限公司，河北 秦皇岛066600； 3.河北皓海生物科技有限公司，河北 秦皇岛066004)

罗非鱼腐皮病病原菌分离鉴定及其对中草药敏感性试验

高桂生1，张艳英1，高光平1，史秋梅1*，李星灿1，韩红升2，黄晓媛2，缴宝丰2，宋青春3

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛066600； 2.秦皇岛粮丰海洋生态科技股份有限公司，河北 秦皇岛066600； 3.河北皓海生物科技有限公司，河北 秦皇岛066004)

为了研究罗非鱼腐皮病的防治方法，通过形态学观察、生化特性等鉴定方法，从患腐皮病的罗非鱼体内分离到1株温和气单胞菌，并进行致病性试验和中草药药敏试验。致病性试验结果显示，分离细菌对罗非鱼有较强的致病作用。中草药药敏试验结果显示：五倍子、乌梅、沙棘、苏木4种单味中草药对分离细菌有较强的抑菌作用，石榴皮次之，陈皮、石菖蒲、鱼腥草、马齿苋、穿心莲、桉树叶、薄荷等无抑菌作用，且五倍子+乌梅的组方抑菌效果最强。

罗非鱼； 腐皮病； 温和气单胞菌； 分离鉴定； 中草药

腐皮病是淡水鱼类严重的细菌性疾病之一[1-2]，孙其焕等[3]报道了尼罗罗非鱼的溃烂病和腐皮病，唐士良等[4]发现了鲢、鳙鱼的腐皮病。鱼类的溃烂病和溃疡病主要是淡水、海水和冷水性鱼类的体表发生溃疡，溃疡多数发生在体表局部某些特定的部位，如发生在鱼体的头部、鱼体背鳍和腹鳍以后的躯干部分、背鳍两侧等。有些病例无特定发生部位，溃疡在多个部位均可发生，有的是全身性体表大面积的溃疡。其病原主要有气单胞菌、弧菌、爱德华氏菌、假单胞菌等。这些致病菌中多数为条件致病菌，有单一菌致病，也有多种菌混合感染。目前，对腐皮病的防控和治疗主要依赖传统的化学消毒剂、抗生素，但长期使用这些药物，会使致病菌的耐药性不断增强。用中草药替代抗生素是水产疾病防治的发展趋势[5-6]，为此，本试验分离鉴定罗非鱼腐皮病病原菌，并进行中草药敏感性试验，旨在寻求健康绿色的药物来治疗腐皮病，以期为鱼类细菌性疾病防治提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 病料来源

病料取自昌黎县某养殖场因腐皮病濒临死亡的罗非鱼。患病鱼体质量170～210 g，体长13～17 cm。

1.2 试剂和培养基

ID 32 E肠杆菌科细菌鉴定试纸条购自北京威泰科生物技术有限公司，革兰氏染色试剂购自海博生物技术有限公司，普通琼脂培养基、营养肉汤购自北京路桥技术股份有限公司，5%绵羊鲜血琼脂培养基自制，药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，自动化微生物鉴定生化试剂盒购自北京威泰科生物技术有限公司。陈皮、马齿苋、石菖蒲、穿心莲、鱼腥草、乌梅、苏木、五倍子、薄荷、沙棘、桉树叶、石榴皮等12种中草药购自秦皇岛百草堂大药房。

1.3 仪器设备

双人单面净化工作台SW-CJ-2FD由苏州净化设备有限公司生产，电热恒温培养箱 HPX-9162MB由上海博迅实业有限公司生产，自动化微生物鉴定系统由北京威泰科生物技术有限公司生产。

1.4 细菌分离培养

人工处死濒临死亡的罗非鱼后，用清水冲洗干净，用乙醇消毒体表。以无菌操作剖开鱼体，从肝、脾、肠病灶处取病原菌，再用无菌接种环取样划线，分别接种到培养皿中，28 ℃恒温培养24 h，并进行溶血试验和染色镜检。

1.5 生化特性鉴定

对分离到的细菌进行纯化培养，挑取单个优势菌落接种到培养皿中纯化培养。无菌条件下取纯化培养的单个菌落于3 mL 0.85% NaCl悬浮培养基中，制备浊度相当于0.5麦氏单位的菌悬液。用移液器取待鉴定的已混匀的菌悬液55 μL，加入到ID 32 E肠杆菌科细菌鉴定试纸条中的每个生化反应杯中，28 ℃培养14～24 h，在自动化微生物鉴定系统仪器上进行生化鉴定。

1.6 致病性试验

取健康的罗非鱼5尾(昌黎县某养殖场提供)，其中1尾(编号5)作为对照组，其他4尾(编号为1—4)每尾注射含分离菌的肉汤0.3 mL(约含5.0×106cfu)。试验期间正常投喂换水，观察罗非鱼的变化，记录罗非鱼的发病及死亡情况，取濒死或发病的鱼心、肝、肾等进行细菌分离鉴定。

1.7 中草药药敏试验

用打孔法做药敏试验，进行3个重复。首先进行单味中草药药敏试验，然后根据12种单味药的药敏试验结果，挑选出排列前4位的中草药再组方进行药敏试验。中草药药液的制备：先取陈皮、马齿苋、石菖蒲、穿心莲、鱼腥草、乌梅、苏木、五倍子、薄荷、沙棘、桉树叶、石榴皮12种中草药各100 g，分别用水浸泡1 h后，将500 mL蒸馏水加入100 g中草药中，煎制30 min，待液体剩下100 mL时，过滤即得到质量浓度为1 g/mL的药液，4 ℃保存备用。药敏试验：在超净工作台中，取适量细菌培养物涂布于普通营养琼脂培养基上；用灭菌的不锈钢小管在培养基上打孔(孔径6 mm左右)，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分与平皿融合(以防药液渗漏)；加入各单味中草药药液(药液加至满而不溢为止)。将平皿培养基置于28 ℃恒温培养箱中24 h后查看结果,单味中草药及组方的抑菌直径取平均值。判定标准：无抑菌圈为耐药；抑菌圈7～10 mm为低度敏感；抑菌圈11～15 mm为中度敏感；抑菌圈≥16 mm为高度敏感。

2 结果与分析

2.1 临床症状及剖检变化

罗非鱼患腐皮病后游动缓慢，食欲减退，抵抗力下降，严重时停止摄食，鱼体失去平衡。体表局部发炎，头部、背部、腹部、尾柄、体侧部分出现黄豆至蚕豆大小的红斑，严重的表皮、肌肉溃烂，呈洞穴状，有的露出骨骼和内脏，严重者有整个身体表皮烂掉，最后死亡。剖检可见病鱼脏器粘连,肝脏充血肿大，胆囊充盈，肠有大量黏液。

2.2 细菌分离培养结果

分离细菌于28 ℃培养24 h后，均生长出细菌菌落。菌落呈圆形，光滑湿润，边缘整齐，半透明，灰白色菌落(图1)。菌落转接到5%绵羊鲜血琼脂培养基培养12～24 h，呈β型溶血(图2)。染色结果显示，分离细菌为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，有个别菌体稍弯曲(图3)。

图1 营养琼脂上的分离细菌菌落

图2 分离细菌在血液琼脂上培养结果

图3 分离细菌革兰氏染色结果

2.3 分离细菌生化特性鉴定结果

由表1可知，分离细菌酯酶、精氨酸双水解酶、d-海藻糖、d-麦芽糖、 β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖等试验均为阳性，L-阿拉伯糖、d-甘露醇、丙二酸盐、D-阿拉伯糖醇、L-天冬氨酸芳胺酶、 β-葡萄糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶、5-酮基葡糖酸盐、赖氨酸脱羧酶等试验均为阴性。综上，分离细菌培养特性和生化特性符合温和气单胞菌的特征。

表1 分离细菌主要生化特性鉴定结果

注：阳性为+，阴性为-。

2.4 分离细菌致病性试验结果

将分离菌株接种到健康罗非鱼体内，试验鱼感染后6 h表现为游动缓慢、不觅食，体表见溃疡。感染后12 h内死亡率达60%，对照组未见异常，剖检发现鱼腹腔内有血样腹水，肝脏有充血，发病症状与自然感染的罗非鱼症状相似，在感染死亡的鱼中分离菌株进行培养鉴定，有与注射菌株形态、生化一致的细菌，表明分离菌株是罗非鱼体表腐烂病的病原菌。

2.5 分离细菌中草药药敏试验

药敏试验结果显示，五倍子、乌梅、沙棘、苏木有较强的抑菌效果，石榴皮次之，陈皮、石菖蒲、鱼腥草、马齿苋、穿心莲、桉树叶、薄荷等无抑菌作用。根据12种单味药的药敏试验结果，挑选出排列前4位的五倍子、乌梅、沙棘、苏木组成组方1(五倍子、乌梅)、组方2(五倍子、沙棘)和组方3(五倍子、苏木)，并进行药敏试验，结果显示，组方1 抑菌效果最强(表2)。

表2 各单味中草药和组方平均抑菌圈直径 mm

3 结论与讨论

罗非鱼腐皮病是最常见的一种细菌性疾病，本研究从患腐皮病的罗非鱼内脏分离到的细菌，经形态学和生化试验鉴定为温和气单胞菌。致病试验结果表明，分离菌有强的致病性。唐士良等[4]通过对鲢鱼、鳙鱼腐皮病的病原初步鉴定后，认为其与腐败极毛杆菌相似；王肇赣等[7]将尼罗罗非鱼腐皮病的病原鉴定为嗜水气单胞菌嗜水亚种；萧克宇等[1]、姚东瑞等[8]将泥鳅腐皮病、溃烂病的病原菌鉴定为温和气单胞菌。本研究结果与前人研究报道基本一致。

温和气单胞菌普遍存在于自然界中，世界各地均有分布[9]，感染谱广，是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一,能引起鱼类、爬行类、两栖类等冷血动物如日本鳗鲡败血腹水病、异育银鲫溶血性腹水病、团头鲂、斑点叉尾回鱼、泥鳅、罗非鱼、鲤鱼的出血性败血症等[10-15]。史秋梅等[16]报道了温和气单胞菌引起的鳖红底板病、红脖子病。温和气单胞菌属条件致病菌,其主要致病原因是产生的各种溶血素和细胞毒素、肠毒素等多种毒素[17]，这些毒素具有多种生物学活性,一旦条件适宜，温和气单胞菌便大量繁殖,其毒素可引起生物体广泛而复杂的病理变化。因此，在罗非鱼集约化养殖过程中,尤其是越冬期间,控制水质和环境生态是防治该病的关键。本研究结果表明，温和气单胞菌对五倍子、乌梅、沙棘、苏木4种单味中草药及五倍子、乌梅组方敏感，发病时可以选择敏感药物及其组方进行治疗。

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Isolation,Identification of Pathogenic Bacteria of Rotten Skin Disease inTilapiamossambicaand Sensitivity Test to Chinese Herbal Medicine

GAO Guisheng1,ZHANG Yanying1,GAO Guangping1,SHI Qiumei1*,LI Xingcan1,HAN Hongsheng2,HUANG Xiaoyuan2,JIAO Baofeng2,SONG Qingchun3

(1.Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao 066600,China; 2.Qinhuangdao Liangfeng Haiyang Biologicag Co.,Ltd,Qinhuangdao 066600,China; 3.Hebei Hao Hai Biologicag Co.,Ltd,Qinhuangdao 066604,China)

To investigate the prevention and treatment method of rotten skin onTilapiamossambica,Aeromonassobriawas isolated fromTilapiamossambicawith rotten skin disease and determined by bacterial morphology observation and biochemical characteristics.Meanwhile,animal regression test demonstrated that it had a relatively strong pathogenicity.The result of sensitivity test to Chinese herbal medicine showed that allnut,dark plum,sea-buckthorn and sappan wood had a strong bacteriostasis,Pericarpium granati had taken second place；but pericarpium citri reticulatae,Acorustatarinowii,houttuynia cordata,purslane,Herbaandrographitis,eukalyptusblatter and herba menthae haplocalycis had no bacteriostasis.Among these Chinese herbal medicine,allnut and dark plum had the strongest bacteriostasis.

Tilapiamossambica; rotten skin;Aeromonassobria; isolation and identificatiaon; Chinese herbal medicine

2016-01-22

河北省科技厅奖励性后补助项目(15926620H)；秦皇岛市科技局科技支撑计划项目(201401A067，201402B043)

高桂生(1964-)，男，河北玉田人，副教授，硕士，主要从事水产养殖动物疾病防治研究。 E-mail:ggs1964@163.com

*通讯作者：史秋梅(1965-)，女，河北乐亭人，教授，博士，主要从事动物传染病防治研究。E-mail:shiqiumei@126.com

S855.1

A

1004-3268(2016)05-0148-04