麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析

熊宏++陈海涛++宋健++余进德++丁勇

摘要：分离克隆麻风树油质蛋白基因家族成员JcOle16.6基因的DNA序列（GenBank序列号为JX073622.1）。JcOle16.6基因全长601 bp，没有内含子，转录的JcOle16.6 mRNA具有468 bp的完整开放阅读框，编码含155个氨基酸残基、分子量为16.6 ku、等电点为9.99的JcOle16.6蛋白（GenBank序列号为AFP19884），属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。JcOle16.6属于稳定的两性蛋白质，具有3个结构域，即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域，肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域，C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内，存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在JcOle16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。研究结果为JcOle16.6基因表达调控和生理功能等研究奠定了基础。

关键词：麻风树；种子；油体；油质蛋白；基因克隆；序列分析

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0084-06

收稿日期：2015-10-28

基金项目：国家自然科学基金（编号：31460076）；云南省高校优势特色重点学科建设项目（编号：50097505）；云南省高校林下生物资源保护及利用科技创新团队项目。

作者简介：熊宏（1994—），男，江西宜春人，硕士研究生，研究方向为代谢途径与分子生物学。E-mail：1570530221@qq.com。

通信作者：丁勇，高级实验师，硕士生导师，研究方向为分子生物学。E-mail：dingyong@swfu.edu.cn。可作为现代生物质能源的植物油广泛存在于植物种子中[1-2]，植物油是植物种子最有效的能量储备形式，其主要以三酰甘油（triglycerides，TAGs）液态基质形式存在于植物亚细胞器颗粒-油体中，可为随后的代谢过程和其他生命活动提供能量和碳水化合物[3-4]。研究认为，TAGs位于油体内部，油体外部为由磷脂单分子层（phospholipids，PL）和油体结合蛋白组成的半单位膜结构[5]。油体结合蛋白包括大量的油质蛋白和微量的油体钙蛋白、油体固醇蛋白Steroleosin-A和Steroleosin-B[6-9]。研究推测油质蛋白作为最丰富的油体结合蛋白在油体的发生到分解消失过程中起着重要的生物学功能[1，10-11]。目前在油桐（Verniciafordii）[12]、油菜（Brassica campestris）[13-16]、芝麻（Sesamumindicum）[17-18]和拟南芥（Arabidopsis thaliana）[19]等物种中油质蛋白基因已被克隆，其生物学功能也得到了一定研究，同时发现在各物种中油质蛋白以多个异构体蛋白形式存在。

麻风树（Jatropha curcas L.）别称小桐子或膏桐，是大戟科（Euphorbiaceae）多年生落叶灌木或小乔木，其果实采摘期长达50年，种仁的含油率高达60%～70%[20-21]，麻风树已经作为生物质能源植物得到了一定的开发与利用[22-24]。研究麻风树油质蛋白及其基因将有助于揭示麻风树种子油体形成与稳定机制，并可为麻风树种子在新型生物能源及植物生物反应器方面深入开发与利用提供理论依据。本研究从 GenBank 数据库中搜索得到已知登录的麻风树油质蛋白家族基因mRNA全长序列（GenBank序列号为EU234462.2、EU234463.2、EU234464.2），但有关麻风树油质蛋白基因DNA序列克隆和序列分析的相关报道还未发现。笔者所在课题组根据EU234464.2序列设计特异性引物，克隆了麻风树油质蛋白家族基因JcOle14.3在染色体上的DNA序列（GenBank序列号为JX073623.1）。本研究根据EU234463.2序列设计特异性引物，克隆麻风树油质蛋白家族基因JcOle16.6在染色体上的DNA序列（GenBank序列号为JX073622.1），并对该基因序列及其推测编码的JcOle16.6蛋白进行生物信息学分析。

1材料与方法

1.1材料与试剂

试验材料为三年生麻风树植株，取其未成熟种子和幼叶于液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

植物总RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）、M-MLV反转录试剂盒和pMD18-T载体均为TaKaRa产品，植物基因组DNA提取试剂盒为北京天根生物技术有限公司产品，胶回收试剂盒为Omega产品，大肠杆菌DH5α为实验室保存菌种，其他化学试剂均为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

1.2试验方法

1.2.1总RNA提取与检测麻风树幼叶基因组DNA提取按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书完成，麻风树种子总RNA提取参照丁勇等方法[25]完成；DNA完整性和纯度分别采用1.0%琼脂糖凝胶糖电泳和紫外分光光度计检测，RNA完整性和纯度分别采用1.2%琼脂糖凝胶糖电泳和紫外分光光度计检测。

1.2.2麻风树JcOle16.6基因克隆在已知麻风树油质蛋白基因mRNA全长序列（GenBank序列号为EU234463.2）的ORF区外侧设计引物，上游引物为JcOle16.6F：5-CTTTCTCACACTTATCATCAAC-3，下游引物为JcOle16.6R：5-TAAACCAACTCAACTACCTCAA-3，并由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列合成。以提取的总RNA为模板，采用反转录试剂盒合成第一链cDNA，取第一链cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25μL的RT-PCR反应体系，克隆目的基因cDNA序列，反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取2 μL DNA为模板，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25 μL的PCR反应体系，克隆目的基因在染色体上的DNA序列，反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.3PCR产物检测、回收、T/A克隆与测序应用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的片段回收后连接到pMD18-T载体上，将重组子转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化复苏后的菌液涂布在含有Amp、IPTG和X-Gal的LB固体培养基上，过夜培养后随机筛选白色菌落，将阳性克隆菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司完成测序。

1.2.4序列的生物信息学分析生物信息学分析参照已知文献报道的方法[15，26-27]进行，包括mRNA及推导的蛋白质氨基酸序列相似性搜索，mRNA开放阅读框查找，蛋白理论分子量、等电点、氨基酸含量和稳定性分析，系统发生树构建，蛋白质亲水/疏水性特性、跨膜结构、信号肽及功能域预测，目的蛋白二级、三级结构预测。

2结果与分析

2.1麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆

本研究以提取的总RNA和基因组DNA为模板分别进行RT-PCR和普通PCR试验，均获得1条位于500～750 bp区间的特异性cDNA和DNA条带（图1），将目的cDNA和DNA条带进行胶回收、TA克隆和测序，结果表明，本研究克隆到的麻风树油质蛋白基因cDNA序列长601 bp，序列与GenBank数据库中登录的麻风树油质蛋白基因mRNA序列EU234463.2具有100%的相似性，本研究克隆到的麻风树油质蛋白基因DNA序列也为601 bp，序列与601 bp的cDNA序列完全一致。根据生物信息学分析结果，本研究将该目的基因命名为麻风树油质蛋白JcOle16.6基因，其601 bp的DNA序列登录GenBank的序列号为JX073622。表明JcOle16.6基因只包含1个外显子，没有内含子。

2.2序列分析

本研究克隆获得麻风树JcOle16.6基因601 bp的基因组DNA序列，其转录的601 bp的mRNA具有完整的ORF，位于第25至第492 bp区域，第1至第24 bp区域为5′UTR，第493至第601 bp区域为3′UTR。ORF推测编码的麻风树油质蛋

白JcOle16.6（GenBank序列号为AFP19884）由155个氨基酸残基组成，相对分子质量为16.6 ku，带负电荷的氨基酸残基（天冬氨酸+谷氨酸）为9个，带正电荷的氨基酸残基（精氨酸+赖氨酸）为16个，pI为9.99，推测JcOle16.6在生理条件下为碱性蛋白。除谷氨酰胺和半胱氨酸之外，JcOle16.6含有其他18种常见的氨基酸残基，色氨酸含量最低，为0.6%，天冬氨酸、酪氨酸含量也较低，均为1.3%，亮氨酸含量最高，为12.9%，其他氨基酸含量在2.6%～10.3%之间。因其具有38.97的不稳定系数值，推测JcOle16.6为稳定性蛋白质。

蛋白质相似性分析结果见（图2）显示，麻风树JcOle16.6含有“油质蛋白”保守结构域，属于油质蛋白超家族蛋白之一。JcOle16.6蛋白与油桐（Vernicia fordii）的油质蛋白Ⅱ、胡杨（Populus euphratica）的油质蛋白18.2 ku-like、毛果杨（P. trichocarpa）油质蛋白家族蛋白、蓖麻（Ricinus communis）的油质蛋白1、川桑（Morus notabilis）的油质蛋白5、爱玉子（Ficus pumila var.）的油质蛋白高分子量异构体、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的油质蛋白 5异构体、亚麻（Linum usitatissimum）的油质蛋白高分子量异构体、胡萝卜（Daucus carota）的脂质体膜蛋白、油茶（Camellia oleifera）的Ole Ⅳ蛋白、烟草（Nicotiana sylvestris）的油质蛋白 5-like、甜橙（Citrus sinensis）的油质蛋白 18.2 ku-like等都具有较高的相似性，E值从9×10-75～3×10-56，一致性60%～83%，相似度74%～91%（表1）。但JcOle166蛋白与该课题组克隆的另一个麻风树油质蛋白家族基因JcOle14.3（GenBank序列号为JX073623）编码的异构体JcOle14.3蛋白（GenBank登录号为AFP19885）之间的相似度较低，以致分析结果未能显示出。表明本研究克隆的JcOle16.6基因编码的JcOle16.6蛋白属于麻风树油质蛋白异构体之一。

将13种不同植物的油质蛋白进行序列比对分析，结果见图3，显示麻风树JcOle16.6蛋白与其他的油质蛋白在肽链中间序列具有较高的一致性，而在肽链两端序列却存在较大差异性。1个丝氨酸和3个脯氨酸组成的脯氨酸结（Pro-Knot）

为已知植物油质蛋白序列的标志性结构[12，28]，该保守结构域也存在于麻风树JcOle16.6和其他参比的油质蛋白序列中。

油质蛋白进化树分析结果见图4，大戟科麻风树JcOle 166和大戟科油桐油质蛋白Ⅱ（ADB03185.1）亲缘关系最近，聚为一支，和大戟科蓖麻油质蛋白1（EEF40948.1）聚为一个大支；同样来自麻风树的JcOle14.3（AFP19885.1）和油质蛋白1-like（NP_001295613.1）聚为一支，二者与爱玉子（Ficus pumila var.）的油质蛋白高分子量异构体（ABQ57396.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的油质蛋白5异构体（XP_010524296.1）属于一个大分支，但与JcOle166的系统发育进化距离较远。推测来自不同植物的同一种油质蛋白异构体基因具有较近的进化关系，而来自同一植物的不同油质蛋白异构体基因具有较远的进化关系。

信号肽分析结果未发现可能的信号肽序列存在于JcOle16.6蛋白中，表明该蛋白为非分泌性蛋白。疏水性分析结果见图5，显示JcOle16.6蛋白质肽链在N端1～31位和C端109～155位氨基酸残基区域都表现为高度亲水性，而中间32～108位氨基酸残基区域表现为高度疏水性，表明麻风树JcOle16.6蛋白为两亲性蛋白质，即蛋白的两末端区域为亲水

性，中间区域为疏水性。蛋白质跨膜结构分析结果见图6，显示JcOle16.6蛋白在中间疏水区域存在2个潜在的跨膜螺旋结构域，第49～72位的24个氨基酸残基形成第1个跨膜螺旋结构域，方向为从膜外到膜内螺旋；第80～101位的22个氨基酸残基形成第二个跨膜螺旋结构域，方向为从膜内到膜外螺旋。表明麻风树JcOle16.6蛋白质为含有2个跨膜螺旋结构域的两亲性蛋白质，中间高度疏水区域位于油体半单位膜内，N-末端和C-末端2个高度亲水区域位于油体半单位膜外，即位于胞质内。

功能蛋白质分子在生物体内都会执行特定的生命活动，其多肽链翻译后通常折叠和盘曲成比较稳定的二级结构，并进一步形成高级结构，完成活性功能域构象的构建。二级结构分析结果见图7，显示麻风树JcOle16.6蛋白可能含有3种二级结构类型，分别为α-螺旋占72.26%、随机卷曲占2387%，少量延伸链占3.87%。可见α-螺旋为JcOle16.6蛋白主要二级结构，约占整个肽链的3/4，分别位于18～22位（α1）、31～42位（α2）、45～68位（α3）、75～93位（α4）、

98～152位（α5）氨基酸残基区域。推测JcOle16.6蛋白α-helix的形成可能与预测的2个跨膜螺旋结构域的形成及与油体半单位膜的定位结合有着密切的关系。JcOle16.6蛋白二级结构，尤其是α-螺旋结构在应用I-TASSER程序预测的高级结构（图8）中可清晰显示出。GO功能分类结果显示JcOle16.6与磷脂单分子层膜的油脂储藏体（GO：0012511）相关，并能整合到单分子层膜上（GO：0016021）。因此，根据蛋白质疏水性、跨膜结构、二级结构、高级结构和功能分析结果，推测JcOle16.6蛋白在结构上可分为3个部分：（1）N端约30个氨基酸残基组成的亲水性区域，分布于油体朝向胞浆一面，α1位于此结构域；（2）C端约47个氨基酸组成的α-螺旋两亲性结构域，也分布于油体朝向胞浆一面，α5位于此结构域；（3）肽链中间约78个氨基酸残基组成的高度疏水性跨膜区域，分布于油体半单位膜内，α2、α3、α4位于此结构域，α3、α4之间存在着由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域（图8），这与JcOle16.6蛋白向油体半单位膜的正确定位和油体结构的稳定维持密切相关。

3结论与讨论

油质蛋白是与植物油体特异性结合的主要蛋白质，在油料植物种子中普遍存在[29]，在植物种子成熟过程中油质蛋白几乎覆盖整个油体表面，使得油体虽以互相积压形式充满整个细胞但从不相互聚合，推测油质蛋白与植物油体的形成和稳定有着密切的关系[30-32]。油质蛋白及其基因已在多种植物中得到了一定的研究[33-37]。本研究分离克隆了麻风树油质蛋白基因家族成员JcOle16.6基因长601 bp的DNA序列（GenBank序列号为JX073622.1），JcOle16.6基因在染色体水平上没有内含子，转录的JcOle16.6 mRNA具有468 bp 的完整开放阅读框，编码含155个氨基酸残基、分子量为 16.6 ku 的JcOle16.6蛋白（GenBank序列号为AFP19884），属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。

不同植物来源的油质蛋白在分子量上具有较大的变化。研究表明，特异性存在于植物种子中的油质蛋白分子量在 15～26 ku 之间变化[2]。本研究从麻风树种子中分离克隆的JcOle16.6基因表达的JcOle16.6蛋白分子量也在此范围之内，为16.6 ku，符合Anthony和Huang的分析结果。在蛋白质结构上JcOle16.6可分为3个结构区域，即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域，肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域，C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域均分布于油体朝向胞浆一面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内，存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在JcOle16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。与相关研究关于油质蛋白结构和功能的论述[35]一致，表明油质蛋白基因在不同植物中表达的油质蛋白能形成类似的结构特性并发挥相同的生物学功能。

油质蛋白基因常以为数不多的基因家族形式存在。在裸子植物中只发现1种油质蛋白[36]，在已研究的被子植物中发现在同一植物中存在氨基酸序列和分子量大小都明显不同的多种油质蛋白异构体[37-38]。刘玉君等对麻风树种子油体蛋白进行电泳分析，发现分子量分别为20、24 ku的2种油质蛋白异构体可能存在于麻风树种子油体中[39]。本研究从麻风树种子中分离克隆的JcOle16.6基因产物推测为16.6 ku的油质蛋白，同时笔者从麻风树种子中成功克隆的JcOle14.3基因产物推测为14.4 ku的油质蛋白。推测麻风树油质蛋白基因也以基因家族形式存在，其表达产物可能以不同分子量油质蛋白异构体形式同时存在于同一油体中。

油质蛋白作为植物油体中发现最早、含量最丰富的油体结合蛋白被认为是需要长期贮藏的油体所必需的[40]，推测从油体的发生到分解消失过程中发挥重要的生物学功能。研究推测油质蛋白在植物种子发育及成熟过程中直接影响油体的形成、稳定性以及大小[41]，在种子萌发、油体动员与解体过程中可作为酯酶识别并结合油体的特殊信号[42-43]。但JcOle16.6及其他异构体蛋白在麻风树种子油体的发生到分解消失过程中的具体生物学功能还有待于进一步研究阐明。

本研究分离克隆了麻风树油质蛋白基因家族成员JcOle16.6基因长601 bp的DNA序列（GenBank序列号为JX073622.1），JcOle16.6基因没有内含子，转录的JcOle16.6 mRNA具有468 bp的完整开放阅读框，编码含155个氨基酸残基、分子量为16.6 ku的JcOle16.6蛋白（GenBank序列号为AFP19884），属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。JcOle16.6具有3个结构域，即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域，肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域，C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一面，中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内，存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在JcOle16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。

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