滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

2016-07-25 18:03张晓东李彩霞王连春王元忠
江苏农业科学 2016年6期
关键词:生物信息学分析表达分析基因克隆

张晓东+李彩霞+王连春+王元忠

摘要:根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物,使用逆转录PCR(RT-PCR)技术从滇龙胆幼叶扩增该基因,并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明:GrAACT基因(登录号KJ917163)开放阅读框长 1 215 bp,编码404个氨基酸;GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku,pI值为6.25,属于AACT蛋白家族成员,无信号肽,为疏水稳定蛋白,主要由α-螺旋、无规则卷曲构成;GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域:硫解酶N端结构域(第12~272位氨基酸)、硫解酶C端结构域(第282~402位氨基酸)、类硫解酶结构域(第13~403位氨基酸);在硫解酶C端结构域中,包含硫解酶保守位点(第350~366位氨基酸)、硫解酶活性位点(第385~398位氨基酸);滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近;GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为6741 ku;组织特异性表达分析结果表明,GrAACT基因主要在茎、根中表达。

关键词:滇龙胆;乙酰CoA酰基转移酶;基因克隆;生物信息学分析;表达分析

中图分类号: S184;R282.71;Q785文献标志码: A文章编号:1002-1302(2016)06-0094-05

收稿日期:2015-05-27

基金项目:国家自然科学基金(编号:81260608);国家科技支撑计划(编号:2011BAI13B02-04);云南省教育厅科学研究基金重点项目(编号:2015Z171)。

作者简介:张晓东(1980—),男,河南新郑人,博士,副教授,从事植物代谢基因工程研究。E-mail:zxd95@126.com。

通信作者:王元忠,硕士,助理研究员,从事药用植物资源评价与利用的研究。E-mail:boletus@126.com。滇龙胆是传统中药龙胆的来源植物之一,也是云南省重要道地药材,主要分布于中国西南部,尤其是云南省山区地带;其根入药,用于治疗各种炎症、肝炎、风湿病和胆囊炎等[1]。目前,医用龙胆需求量每年递增约10%,而现有滇龙胆产量低、品质不高,且野生滇龙胆资源遭到人为大肆采挖[2]。为选育优质、高产、高抗新品种,2013年6月云南省已启动龙胆草航天育种工程[3]。从中医药现代化角度来看,滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷,要从根本上解决龙胆草药源问题并保护野生滇龙胆,除筛选新品种之外,还必须弄清龙胆苦苷的生物合成途径及其调控机理,为通过基因工程手段生产龙胆苦苷奠定基础。

龙胆苦苷为裂环烯醚萜类化合物,在植物中主要通过质体2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)、胞质甲羟戊酸(MVA)途径合成[4]。乙酰CoA酰基转移酶(又称乙酰乙酰CoA硫解酶,AACT,EC 2.3.1.9)是MVA途径中的第1个限速酶,能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[5]。目前,乙酰CoA酰基转移酶基因AACT已从拟南芥[5]、丹参[6]、胡萝卜[7]、白木香[8]、油茶[9]等许多植物中分离。AACT基因表达具有组织特异性,并被生物、非生物因素诱导。拟南芥中存在2个平行进化的同源基因,其中AtAACT1主要在维管系统中表达,AtAACT2则在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达,二者存在功能冗余;AtAACT2的作用是为胞质定位、MVA起源的异戊烯萜类生物合成途径合成大量乙酰乙酰CoA前体[5]。在生物诱导剂(100 mg/mL酵母提取物)、非生物诱导剂(30 mmol/L Ag+)共同诱导下,丹参SmAACT基因在诱导后12 h的表达量达到最高值[10]。

目前,由于龙胆基因组资源极度匮乏[11],导致龙胆苦苷生物合成途径并不清楚[3]。本研究根据笔者实验室滇龙胆转录组数据库中的GrAACT基因序列,设计特异性引物,通过逆转录PCR(RT-PCR)技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到GrAACT基因,并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性分析,以期为阐明滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

滇龙胆组培苗、盆栽苗均采自玉溪师范学院分子生物学实验室,经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆(Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl)。基因克隆所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶,基因组织特异性表达分析所用材料为盆栽3年生滇龙胆的根、茎、叶,采样日期为2014年5月17日。

1.2方法

按照多糖植物组织提取试剂RNAiso(TaKaRa,大连)说明书提取滇龙胆幼叶总RNA;按照逆转录试剂盒(TaKaRa,大连)说明书合成cDNA。根据原核表达载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点和笔者所在实验室前期测序的滇龙胆转录组GrAACT基因序列,设计1对特异引物GrAACT BamHⅠ-F、GrAACT XhoⅠ-R(表1)。以cDNA为模板进行PCR扩增,反应体系为:0.5 μL TransTaq Taq DNA Polymerase High Fidelity(2.5 U/μL,北京全式金生物技术有限公司),5 μL 10×TransTaq HiFi Buffer Ⅱ,4 μL dNTP(2.5 mmol/L,TaKaRa,大连),2 μL模板,各1 μL正反向引物(10 μmol/L),加dd H2O补足至50 μL。PCR反应条件为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55.5 ℃ 30 s,72 ℃ 75 s,30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离,然后割胶,使用胶回收试剂盒(Qiagen,德国)对目的片段进行回收,将其连接到pMD19-T载体(TaKaRa,大连)。转化大肠杆菌DH5α(TaKaRa,大连)后进行蓝白斑筛选,挑取12个白斑摇菌;使用试剂盒提取质粒(北京百泰克生物技术有限公司),经酶切检测正确后进行测序[生工生物工程(上海)股份有限公司],获得重组质粒pMD19-GrAACT。

1.2.1GrAACT基因的生物信息学分析用NCBI网站的BLAST程序进行序列比对,用Genetyx 6.1.8进行翻译,用DNAMAN 7进行多序列比对,用Clustal X2.1进行比对,然后用MEGA 6.0软件内置的NJ法构建系统进化树,设置Bootstrap=1 000;利用在线数据库(http://molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html)进行稀有密码子分析。用ChloroP服务器v1.1进行叶绿体转运肽预测;用Interpro软件进行保守结构域预测;用ProtScalee软件进行疏水性分析;用PredictProtein对二级结构进行预测;用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)对三级结构进行预测;用Expasy中的TMHMM工具预测蛋白的跨膜螺旋区;用在线工具WOLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位情况。

1.2.2GrAACT基因的荧光实时定量分析分别取3年生滇龙胆的根、茎、叶,提取总RNA,用DNase I处理除去基因组DNA。用反转录试剂盒(TaKaRa)合成第1链cDNA。以转录组中GrGAPDH基因(GenBank登录号KM061807)作为内参设计特异性引物(表1),PCR条件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 31 s。根据GrAACT基因开放阅读柜(ORF)序列设计特异性引物(表1),使用SuperReal PreMix Plus试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]进行qPCR,扩增条件为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 31 s;每个反应重复3次。反应在ABI7000荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行扩增,扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量PCR仪软件自动生成。使用内参基因GrGAPDH表达校准后,计算根、茎、叶中GrAACT基因的相对表达量。采用比较CT值的“2-ΔΔCT”的方法进行定量数据的分析处理。

2结果与分析

2.1滇龙胆GrAACT基因的克隆

以滇龙胆幼叶cDNA为模板,使用表1中的基因特异性引物GrAACTBamHI-F、GrAACTBamHI-R扩增出约 1 200 bp 的片段,详见图1。通过TA克隆获得重组质粒 pMD19-GrAACT。

2.2GrAACT基因的生物信息学分析

2.2.1GrAACT基因的ORF分析和多序列比对分析利用Genetyx软件对GrAACT基因的ORF序列进行分析,结果显示:该基因(GenBank登录号KJ91716)长1 215 bp,编码404个氨基酸。利用GenBank数据库的BLASTp程序对GrAACT蛋白进行比对分析,结果表明:滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白的序列相似性最高(88.61%),与单子叶植物玉米ZmAACT蛋白的相似性(78.55%)稍低。利用DNAMAN 7将GrAACT蛋白序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行多序列比对分析,结果表明:GrAACT蛋白与已知蛋白序列相比保守性较高(图2)。利用Mega 6.0将GrAACT氨基酸序列与NCBI中相似性较高的部分序列进行系统发育分析,结果显示:滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白处于同一进化支(图3),表明二者亲缘关系较近。

2.2.2GrAACT蛋白的理化特性分析使用ExPASy ProtParam tool对GrAACT蛋白进行分析,结果表明:GrAACT蛋白单体相对分子质量为41 410 u,pI值为6.25,这与丹参SmAACT蛋白[6]、油茶CoAACT蛋白[9]、拟南芥ATAACT2蛋白[5]类似;带正电氨基酸残基(Arg+Lys)数为36个,带负电氨基酸残基(Asp+Glu)数为38个,化学式为:C1812H2959N509O562S17;不稳定指数为27.92,属稳定蛋白;脂肪指数为9856,总平均疏水性(GRAVY)为0.178,为疏水蛋白(图4)。GrAACT蛋白含20种基本氨基酸,其中丙氨酸含量最高,为13.9%;其次是甘氨酸、缬氨酸,含量分别为11.9%、9.9%;色氨酸含量最低,为0.5%。

2.2.3GrAACT蛋白的二级结构、三级结构分析利用SSpro方法对GrAACT蛋白进行二级结构分析,结果表明:该蛋白二级结构中α-螺旋(H)占39.11%,无规则卷曲(C)占40.10%,延伸带(E)占20.79%。利用Swiss-Model Workspace的自动模式预测GrAACT蛋白的三级结构,结果见图5,该模型以人线粒体乙酰CoA酰基转移酶[2f2s.1.C]为模板,在第13—404位氨基酸处建模,序列相似度为52.73%。

2.2.4GrAACT蛋白保守结构域分析使用InterPro在线工具对GrAACT蛋白的保守结构域进行分析,结果表明:GrAACT

蛋白包含3个保守结构域,它们分别为硫解酶N端结构域(IPR020616,第12—272位氨基酸)、硫解酶C端结构域(IPR020617,第282—402位氨基酸)、类硫解酶结构域(IPR016039,第13—403位氨基酸)(图6)。在硫解酶C端结构域中,包含硫解酶保守位点(THIOLASE_2,第350—366位氨基酸)、硫解酶活性位点(THIOLASE_3,第385—398位氨基酸)。

2.2.5GrAACT蛋白信号肽分析利用ExPASy SignalP 4.1服务器分析GrAACT蛋白,未发现信号肽,表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用TMHMM工具预测GrAACT蛋白的跨膜螺旋区,结果表明:GrAACT蛋白不含有跨膜区域(图7)。

2.2.6GrAACT蛋白亚细胞定位分析使用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位分析,结果表明,GrAACT蛋白在细胞质、叶绿体、过氧化物酶体的定位系数分别为6.0、4.0、3.0。

2.2.7GrAACT基因稀有密码子分析使用在线软件对GrAACT基因进行稀有密码子分析,结果表明:GrAACT基因中稀有密码子占1.48%,且无二联或三联稀有密码子连续出现的情况,因此可选用大肠杆菌表达菌BL21或Rosetta(DE3)进行原核表达。

2.3GrAACT基因原核表达载体的构建

使用酶切检测重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT,结果表明:BamHⅠ、XhoⅠ双酶切可切出目的基因和载体,且二者长度之和等于XhoⅠ单酶切产物长度(图8),表明GrAACT基因已成功插入载体pGEX-4T-1。

2.4GrAACT基因的原核表达

将重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,在37 ℃、1 mmol/L IPTG(终浓度)下,分别

诱导表达0、2、4、6 h后,提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析。结果表明:与对照(第1~3泳道)相比,pGEX-4T-1-GrAACT转化菌经IPTG诱导后,在相对分子质量67 410 u(含GST蛋白26 000 u)左右有1条蛋白条带,并且随诱导时间增加,其蛋白含量逐渐升高(图9),表明重组质粒pGEX-4T-1-GrAACT在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功诱导表达了GrAACT蛋白。当温度为37 ℃、诱导时间为6 h时,蛋白表达量最大(图9),细胞破碎后可直接用于蛋白纯化。

2.5GrAACT基因的组织表达分析

取3年生滇龙胆的根、茎、叶,提取总RNA,反转录成cDNA后,通过实时荧光定量RT-PCR分析GrAACT基因在根、茎、叶中的表达情况。图10结果表明:GrAACT基因在茎中表达量最高,分别约为叶、根的13.17、1.36倍,表达量最低的是叶。

3讨论

滇龙胆药效成分龙胆苦苷是通过MVA、MEP途径合成的,在前期笔者已经克隆了MEP途径关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR[12]。为阐明龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理,本研究克隆了MVA途径中的GrAACT基因。AACT是MVA途径的第1个催化酶,因此滇龙胆中GrAACT基因的表达情况可以直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。研究表明,植物中如丹参[6]、白木香[8]、油茶[9]AACT蛋白均包含硫解酶N端结构域、C端结构域和保守位点。本研究从滇龙胆幼叶中克隆获得GrAACT基因,其编码蛋白序列比对分析结果表明,GrAACT蛋白属于AACT家族蛋白,具有硫解酶N端、C端结构域,并且在其C端具有保守位点:NVHGGAVALGHPLGCSG(第350—366位氨基酸)。这些结果表明,所克隆基因的确为滇龙胆乙酰CoA酰基转移酶基因。

根据底物链长特异性,硫解酶被分为2类:第I类是降解型硫解酶(EC 2.3.1.16),定位于线粒体、过氧化物酶体,在脂肪酸氧化中催化3-酮脂酰CoA断裂产生乙酰乙酰CoA、缩短的酰基CoA;第Ⅱ类是合成型硫解酶(EC 2.3.1.9),定位于细胞质,能够催化2分子乙酰CoA形成1分子乙酰乙酰CoA[13]。生物信息学分析结果表明,GrAACT蛋白定位于细胞质,属于Ⅱ型硫解酶,参与胞质中的MVA途径。在植物中,AACT蛋白的定位还存在争议。在拟南芥中,参与MVA生物合成途径的AtAACT2蛋白定位于细胞质[14];而对拟南芥过氧化物酶体蛋白质组研究结果表明,该蛋白也存在于过氧化物酶体[15]。在向日葵(Helianthus annuus)乙醛酸循环体中,HaAACT能够催化朝向乙酰乙酰CoA方向的反应[16],说明过氧化物酶体中也存在AACT。GrAACT蛋白三维模型预测结果表明,该蛋白的活性形式为四聚体。在本研究中,GrAACT单体相对分子质量为41 410 u,其活性形式可能是单体,也可能是四聚体,这需要通过非变性SDS-PAGE进行进一步检测。

在拟南芥中,参与MVA途径的AtAACT2基因在根尖、幼叶、茎上部和花药中大量表达[5]。组织表达特异性检测结果表明,GrAACT基因在根中的表达量较高,因此推测:滇龙胆根部为龙胆苦苷生物合成的主要器官。滇龙胆用药部分为根,因为与叶、茎相比,根中龙胆苦苷含量最高[17-18],这也为上述假说提供了证据。在拟南芥中,参与MVA途径的AtAACT2基因是多效基因。首先,AtAACT2对于胚胎形成和正常的雄性配子传递是必需的,AtAACT2突变体不能存活;其次,AtAACT2基因的RNAi株系表现出多效的表型,包括减弱的顶端优势、延长的生活周期和开花时间、雄性不育、矮化、种子产量降低、根长变短和植物甾醇类质和量的改变等;再次,当外源添加甲羟戊酸后,AtAACT2基因的RNAi株系以上的表型和生化改变都可逆转[5]。本研究中的GrAACT蛋白与AtAACT2蛋白相似性高达83.87%,GrAACT基因是否也为多效基因,需要进一步试验验证。

本研究为滇龙胆的分子生物学研究提供基因资源,并为GrAACT基因功能的解析奠定基础。下一步将对GrAACT蛋白进行纯化和酶活分析,通过互补试验或过表达研究GrAACT基因的功能,从而为龙胆苦苷生物合成途径的阐明奠定基础。

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