固相萃取-高效液相色谱法测定泻痢消片中4种有效成分

吴江瑞，齐广才，崔生飞，张咪咪，刘珍叶

(延安大学化学与化工学院，延安　716000)



固相萃取-高效液相色谱法测定泻痢消片中4种有效成分

吴江瑞，齐广才*，崔生飞，张咪咪，刘珍叶

(延安大学化学与化工学院，延安716000)

摘要：目的建立采用SPE-HPLC法同时测定泻痢消片中芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷含量的方法。方法采用C18固相萃取柱对泻痢消片中的有效成分进行净化、富集，用HPLC法测定含量。色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-5 mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长为230，276和284 nm，柱温为28 ℃，进样量为20 μL，流速为1.0 mL·min-1。结果芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷分别在0.617 0～30.85(r=1.000 0)，0.159 8～7.944(r=0.999 8)，0.972 8～48.64(r=1.000 0)和0.123 6～6.180 μg·mL-1(r=0.999 9)范围内线性关系良好，平均回收率(n=6)分别为99.4%，98.3%，97.8% 和97.7%。RSD值分别为0.97%，1.11%，1.28% 和1.26%。结论该方法操作简单快捷，灵敏度高，结果准确，可用于泻痢消片中的4种有效成分的含量测定。

关键词：泻痢消片；芍药苷；甘草苷；柚皮苷；橙皮苷；固相萃取；高效液相色谱法

泻痢消片是由酒黄连、酒白芍、木香、枳壳、陈皮、茯苓、甘草等十二味中药组方制成的治疗腹泻腹痛的中药制剂；具有清热燥湿、行气镇痛和化浊止痢的功效；主要用于大肠湿热所致的腹痛泄泻、大便不爽、里急后重、脓血便等症[1-2]。方中酒白芍具有养血调经、柔肝止痛的作用，甘草的功能主要是补脾益气、清热解毒，并辅以枳壳和陈皮起到行滞消胀和理气健脾的作用[3]，对于治疗腹泻痢疾具有良好的效果。目前，关于泻痢消片中有效成分含量的测定尚未见报道，为了更好地控制产品的质量，本文采用高效液相色谱法(HPLC)同时对其中芍药苷[4]、甘草苷[5]、柚皮苷[6]和橙皮苷[7]4种有效成分进行含量测定，并运用固相萃取法(SPE)结合超声提取对样品进行前处理优化[8-13]，以期多指标综合评价其质量，所建立的SPE-HPLC分析方法能够明显减少杂质干扰，具有快速、简捷、准确度高等优点，对泻痢消片的质量控制有重要的指导意义。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1200型高效液相色谱仪

(含二极

管阵列检测器)；电子分析天平(AUY220型)；超声波清洗器(KQ-250B)；固相萃取装置(The BAKER spe-12G Glass Column Processor)，Thermo HyperSep C18固相萃取柱(美瑞泰克科技公司)。

1.2试药芍药苷(批号110736-201438)、甘草苷(批号111610-201106)、柚皮苷(批号110722-200610)和橙皮苷(批号110721-201316)4种对照品均购自中国食品药品检定研究院；泻痢消片(规格：每片0.35 g；批号：LMA1304，LMA1309，LEA1409；云南白药集团丽江药业有限公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯(美国DIKMA公司)；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈(A)-5 mL·L-1磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～6 min，24% A；6～10 min，24% A→30% A)。流速：1.0 mL·min-1；波长切换：0～6 min，230 nm；6～7 min，276 nm；7～10 min，283 nm。柱温：28 ℃，进样量：20 μL，峰面积外标法定量。色谱图见图1。

图1泻痢消片HPLC图谱

A.对照品；B.样品；C.缺白芍阴性样品；D.缺甘草阴性对照；E.缺枳壳阴性对照；F.缺陈皮阴性对照；1．芍药苷；2．甘草苷；3．柚皮苷；4．橙皮苷

Fig.1 HPLC chromatograms of Xielixiao Tablets

A.reference substances；B.sample；C.negative sample without RadixPaeoniaeAlba； D.negative sample withoutLicorice；E.negative sample withoutFructusAurantii；F.negative sample withoutCitrus；1.paeoniflorin； 2.liquiritin；3.naringin； 4.hesperidin

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备准确称取对照品芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷适量，分别置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度分别为192.8，198.6，152.0和308.8 μg·mL-1的单一成分对照品储备液。分别精密量取芍药苷对照品储备液4.0 mL、甘草苷对照品储备液1.0 mL、柚皮苷对照品储备液8.0 mL和橙皮苷对照品储备液0.5 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液Ⅰ(芍药苷30.85 μg·mL-1，甘草苷7.944 μg·mL-1，柚皮苷48.64 μg·mL-1，橙皮苷6.180 μg·mL-1)。

2.2.2供试品溶液的制备取泻痢消片适量，除去包衣，置于研钵，研细混匀，取其粉末约1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加甲醇25.00 mL，密塞，称定质量，超声提取20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取所得续滤液10 mL上样至预先用甲醇(5 mL×2)活化，水(5 mL×2)平衡的固相萃取柱中，然后用5 mL体积分数为3%的甲醇淋洗样品，以小于2 mL·min-1的流速淋洗，弃去全部流出液；用5 mL体积分数为80%的甲醇洗脱，收集洗脱液至10 mL量瓶中。

2.2.3阴性样品溶液的制备按照处方比例及制备工艺，取处方中除白芍、甘草、枳壳和陈皮外的其他药味，制得阴性对照样品，按照2.2.2项下方法制成阴性对照溶液。

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察按照2.1项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品储备液Ⅰ0.50，1.00，3.00，5.00，10.00和25.00 mL，分别置于25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度对照品混合溶液。分别精密吸取上述系列对照品混合溶液各20 μL注入色谱仪，以色谱峰面积Y对对照品质量浓度X(μg·L-1)进行线性拟合。求得芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷回归方程分别为：Y1=15.626X1-0.891 2(r1=1.000 0)，Y2=18.185X2+5.325 2(r2=0.999 8)，Y3=16.057X3+0.239 2(r3=1.000 0)，Y4=17.492X4+2.096 8(r4=0.999 9)。结果表明，芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷分别在0.617 0～30.85，0.159 8～7.944，0.972 8～48.64和0.123 6～6.180μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2精密度实验按照2.1项下色谱条件，精密吸取对照品混合储备液Ⅰ20μL，重复进样6次，测得芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷等峰面积的RSD值分别为0.61%，0.86%，1.08%和2.34%。仪器精密度符合要求。

2.3.3重复性实验按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，取同一批号(批号LMA1304)样品，在上述色谱条件下分别进样20μL，测得峰面积，结果芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷的RSD分别为1.31%，2.68%，0.92%和2.61%，实验结果表明重复性良好。

2.3.4稳定性实验精密吸取同一供试品溶液20μL，按照上述色谱条件，分别在0，2，4，6，8和10h进样，测得芍药苷、甘草苷、柚皮苷和橙皮苷峰面积的RSD值分别为0.82%，1.27%，0.32% 和1.18%。结果表明，供试品溶液在10h内稳定。

2.3.5加样回收率实验精密称取已知含量的样品(批号LMA1304)6份，每份约0.5g，分别精密加入芍药苷对照品溶液(质量浓度为192.8μg·mL-1)1.0mL，甘草苷对照品溶液(质量浓度为198.6μg·mL-1)0.2 mL，柚皮苷对照品溶液(质量浓度为152.0 μg·mL-1)3.0 mL，橙皮苷对照品溶液(质量浓度为308.8 μg·mL-1)0.1 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算回收率，结果见表1。

2.4样品含量测定取3批样品，每批样品取5份，按照2.2.2项下方法分别制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，测定峰面积，按照外标法计算含量，结果见表2。

3讨论

3.1提取方法的选择(1)实验用水、甲醇、乙醇和乙腈4种不同溶剂提取样品，结果表明，用甲醇对样品进行提取优于其他3种溶剂，且与杂质能够有效分离。(2)采用超声法、固相萃取法、超声法结合固相萃取法对样品进行处理，比较各方法可知，超声法提取后样品中的杂质干扰较严重；直接用固相萃取法不能将样品完全提取；超声提取后，再进行固相萃取杂质干扰少，对样品成分的提取效率高，故选用此法。(3)比较超声处理时间10，20，40，60，80和100 min，发现超声20 min即能将被测成分提取完全。(4)比较用甲醇溶液5，15，25，40，50和60 mL提取样品，结果用25 mL甲醇溶液提取的含量最高。

表1加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery tests

(n=6)

表2样品含量测定结果

Tab.2 Determination results of samples

(n=5)

3.2固相萃取条件的优化

3.2.1固相萃取柱的选择实验中比较了Thermo HyperSep C18固相萃取柱和Thermo Hy- perSep Retain PEP固相萃取小柱的萃取效果，结果发现二者对芍药苷和橙皮苷的提取相差甚小，而C18固相萃取柱对甘草苷和柚皮苷的提取优于PEP固相萃取小柱，且分离彻底，故选用Thermo HyperSep C18固相萃取柱。

3.2.2淋洗溶剂的优化分别取样品0.5，2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL对上样体积进行考察，由于样品中杂质干扰较严重，当上样体积大于8.0 mL时，显示出较好的抗干扰效果，为保证回收率，上样体积选取10.0 mL。用水，体积分数分别为1%，3%，5%，8%和10%的甲醇为淋洗溶剂，收集淋洗液，用HPLC检测，结果显示,用体积分数为3%的甲醇淋洗时任何目标物不被洗脱，为了减少杂质的干扰并得到最佳的提取效果，确定用体积分数为3%的甲醇淋洗溶液。

3.2.3洗脱条件的优化选择不同体积分数的甲醇(5%，25%，45%，65%，80% 和100%)溶液进行洗脱，用体积分数为80%的甲醇洗脱，杂质干扰少，提取率也较高。选取洗脱体积(1，3，5，7，9和10 mL)时，用5和7 mL结果并无差异，为了洗脱完全又不浪费溶剂，最终选取5 mL进行洗脱。

3.3检测波长的选择样品中4种苷类物质的色谱峰经二极管阵列检测器检测，其UV光谱与各自对照品的UV光谱一致，芍药苷在230 nm处有最大吸收峰，甘草苷在276 nm处有最大吸收峰，柚皮苷和橙皮苷均在283 nm处有最大吸收峰，因此均选用各自最大吸收峰处的波长作为实验测定波长。

3.4流动相的选择比较流动相(A)甲醇-水，(B)乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液，(C)乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液，结果显示，3种流动相均可达到分离效果，但是用流动相(A)杂质峰干扰严重，而在流动相中加入磷酸(B、C)抑制苷中酚羟基的离解，实验重复性好。(C)比(B)使柚皮苷和橙皮苷的峰形更好，最终选取(C)作为实验的流动相。

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基金项目：延安大学研究生教育创新计划项目

作者简介：吴江瑞，女，硕士研究生

*通信作者：齐广才，男，教授，硕士研究生导师

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.016

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0379-05

(收稿日期：2015-09-15)

Determination of 4 kinds of effective components in Xielixiao Tablets by SPE-HPLC

WU Jiangrui，QI Guangcai*，CUI Shengfei，ZHANG Mimi，LIU Zhenye

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Yan′an University，Yan′an 716000，China)

Abstract:Objective To establish a solid-phase extraction with high-performance liquid chromatography(SPE-HPLC) method for the determination of paeoniflorin，liquiritin，naringin，and hesperidin in Xielixiao Tablets．Methods Using C18solid phase extraction column,the active ingredients of Xielixiao Tablets were purified and enriched．The contents were analyzed by HPLC method with Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)．The mobile phase was composed of acetonitrile and 5 mL·L-1phosphoric acid in gradient elution．Detection wavelength was set at 230，276 and 284 nm．The column temperature was maintained at 28 ℃，and injection volume was 20 μL．The flow rate was 1.0 mL·min-1．Results The calibration curves of paeoniflorin，liquiritin，naringin，and hesperidin showed good linearity within 0.617 0-30.85(r=1.000 0)，0.159 8-7.944(r=0.999 8)，0.972 8-48.64(r=1.000 0)，and 0.123 6-6.180 μg·mL-1(r=0.999 9),respectively．The average recoveries were 99.4%，98.3%，97.8% and 97.7%．RSDs were 0.97%，1.11%，1.28% and 1.26%，respectively．Conclusion The method is simple,fast，sensitive，and accurate，and can be used for the quality control of 4 kinds of effective components in Xielixiao Tablets．

Key words：Xielixiao Tablets；paeoniflorin；liquiritin；naringin；hesperidin；SPE；HPLC