雷公藤甲素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

陈佳园，顾取良，郐一贺，欧意桃，王丽京，李卫东



雷公藤甲素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

陈佳园1，顾取良2，郐一贺1，欧意桃1，王丽京1，李卫东3

（广东药科大学1.血管生物学研究所；2.基础学院；3.健康学院，广东 广州510006）

摘要：目的探究雷公藤甲素对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7增殖的抑制作用。方法取培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，用雷公藤甲素按不同浓度处理24 h后提取细胞蛋白和RNA，用Western blot和RT-PCR来检测磷脂酶D1（PLD1）和c-Myc的表达。结果雷公藤甲素能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖，并且在MDA-MB-231细胞中下调PLD1和c-Myc的表达。结论雷公藤甲素能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7的增殖。

关键词：雷公藤甲素；乳腺癌；磷脂酶D1（PLD1）

乳腺癌是全世界女性癌症患者中最常见的恶性肿瘤之一，因此研究乳腺癌的预防与临床治疗倍受关注［1］。雷公藤是卫茅科雷公藤属木质藤本植物，具有解毒散结、活血化淤、扶正祛邪等多种功效。雷公藤甲素，又称雷公藤内酯醇，是雷公藤主要的有效成分［2］。研究表明，不论是在体内还是体外雷公藤甲素对多种癌症细胞都有抑制作用，其抗肿瘤作用主要与诱导细胞凋亡、干预细胞周期和抑制肿瘤新生血管形成等有关［3］。磷脂酶D（phospholipase D， PLD）在大部分癌症中都有过表达的现象，特别是乳腺癌中［4］。本研究用雷公藤甲素处理乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231，研究雷公藤甲素对乳腺癌细胞增殖的作用以及对PLD1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

MDA-MB-231、MCF-7细胞（上海中科院细胞库）；雷公藤甲素（北京金宝在线科技公司）；Anti-

网络出版时间：2016-05-30 10：07 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1007.001.htmlACTIN鼠单克隆抗体（武汉博士德公司）；Anti-c-Myc兔单克隆抗体（武汉博士德公司）；Anti-PLD1兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology公司）；DMEM培养基（Gibco公司）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司）；RNA提取试剂Trizol（生工生物工程公司）；逆转录试剂盒（TaKaRa公司）。

1.2 主要仪器

Thermo Scientific Series 8000培养箱（赛默飞世尔公司）；Lifepro Thermal Cycler PCR仪（杭州博日公司）；AIRTECH超净工作台（苏净安泰公司）；美国BioTek ELx800通用酶标仪（美国伯腾仪器公司）；GE ImageQuant LAS 4000化学发光成像分析仪（美国通用公司）。

1.3 方法

1.3.1 平板细胞克隆形成实验 分别取乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7 1 000个细胞接种于6孔板培养皿中，贴壁培养24 h后，换液，加药，分别加入含0、20、100 nmol/L不同浓度雷公藤甲素的培养基，培养24 h后，更换为正常培养基，连续培养15 d后，弃去培养基，用PBS洗3×5 min，加甲醇固定30 min，结晶紫染色，拍照比较克隆形成率。

1.3.2 半定量RT-PCR 收集培养的上述2种细胞，用Trizol提取总RNA并测定浓度，取1 μg RNA进行逆转录和半定量PCR。PCR反应条件：95℃，5 min；95℃，1 min；57℃，35 s；72℃，1 min重复28个循环；72℃，10 min；于4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪拍照。引物信息：GAPDH（内参照），Forward-5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，Reverse-5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；c-Myc，Forward：5′-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC-3′，Reverse：5′-GCTGGTGCATTTTCGGTTGT-3′。

1.3.3 免疫蛋白印迹（Western blot） 将细胞随机分为3组：0 nmol/L雷公藤甲素、20 nmol/L雷公藤甲素、100 nmol/L雷公藤甲素。作用24 h后，用预冷的PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液50 μL，冰上裂解30 min，然后以4℃，13 000×g离心10 min，收集离心液保存于-20℃备用。

用BCA法测量蛋白质含量后，取等量蛋白质加入各电泳通道 （各约50 μg）。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜。5%（φ）脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST（pH=7.6）清洗3×5 min，分别加入Anti-PLD1抗体（1∶1 000）、Anti-c-Myc抗体（1∶1 000）以及内参ACTIN（1∶10 000），4℃孵育过夜，TBST清洗3×5 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，再用TBST清洗3×5 min后，ECL法显色。

2 结果

2.1 雷公藤甲素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

平板细胞克隆形成实验结果表明，雷公藤甲素对乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7克隆形成有明显的抑制作用（图1）。

图1　雷公藤甲素对两种乳腺癌细胞增殖的抑制作用Figure 1 Suppression of triptolide on the growth of breast cancer cells

2.2 雷公藤甲素对乳腺癌细胞PLD1蛋白表达的影响

Western blot检测发现，MCF-7细胞PLD1蛋白表达相比MDA-MB-231细胞较低（图2A）；经雷公藤甲素处理后，MDA-MB-231细胞的PLD1蛋白表达随着给药浓度的增加逐渐降低（图2B）。

图2　雷公藤甲素对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中PLD1蛋白表达的影响Figure 2 Effect of triptolide on PLD1 protein expression in MDA-MB-231 and MCF-7 cells

2.3 雷公藤甲素对乳腺癌细胞c-Myc表达的影响

同时采用Western blot和RT-PCR检测雷公藤甲素对乳腺癌细胞中c-Myc表达的影响。MCF-7细胞c-Myc在mRNA水平（图3A）或蛋白水平（图4A）

都没有随给药浓度的增加而发生明显变化；MDA-MB-231细胞的c-Myc在mRNA水平（图3B）和蛋白水平（图4B）的表达随着给药浓度的增加均下调。

图3　雷公藤甲素对MCF-7细胞c-Myc mRNA表达的影响Figure 3 Effect of triptolide on c-Myc mRNA expression in MCF-7 cells

图4　雷公藤甲素对MDA-MB-231细胞c-Myc蛋白表达的影响Figure 4 Effect of triptolide on c-Myc protein expression in MDA-MB-231 cells

3 讨论

PLD包括PLD1和PLD2两个亚型，能够催化磷脂酰胆碱水解成磷脂酸和胆碱，其水解产物可继而激活多条信号通路参与细胞生长和血管生成过程［4］。实验结果表明，在 MDA-MB-231细胞中PLD1高表达，MCF-7细胞中PLD1低表达，结果与KANG等［5］报道的一致；并且，在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系TMX2-28中，PLD1蛋白表达水平比雌激素受体阴性的MCF-7细胞系高10倍以上［6］，提示PLD1的表达水平与雌激素受体相关。有研究报道雷公藤甲素通过雌激素受体而抑制乳腺癌细胞的增殖［7］。同时亦有研究报道，在乳腺癌细胞中c-Myc的表达和PLD水平正相关［8］，在高表达PLD 的MDA-MB-231细胞中c-Myc表达水平也相对较高［9］。

c-Myc基因作为一种原癌基因，在正常细胞中的表达受到严格调控，但在大部分癌细胞中处于活化状态，一些恶性、低分化肿瘤常伴随有c-Myc表达失控［10］。在检测的MDA-MB-231细胞中，PLD1表达水平较高，c-Myc表达水平也较高，随雷公藤甲素给药浓度增加，该细胞内PLD1和c-Myc表达均降低。而在MCF-7细胞中检测到PLD1表达量很低，同时c-Myc表达水平也较高，雷公藤甲素处理后，c-Myc表达量并没有明显改变。因此推测，雷公藤甲素对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用可能是通过降低PLD1的表达而降低了c-Myc的表达，而对MCF-7细胞增殖的抑制作用则可能是通过不同机制来实现的。由于本研究仅检测了PLD1这一亚型的表达变化情况，对于PLD2在雷公藤甲素抑制这两个细胞系的增殖中作用及其与c-Myc表达之间的相关性等仍有待进一步研究。

参考文献：

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（责任编辑：幸建华）

中图分类号：R737.3

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0352-03

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2015110502

收稿日期：2015-11-05

作者简介：陈佳园，男，2013级硕士研究生，Email：chenjiayuan2015@163.com；通信作者：李卫东（1962—），男，博士，教授，主要从事胃肠动力学的中西医结合研究，Email：gylwd26@163.com。

Suppression of triptolide on the proliferation of human breast cancer cells

CHEN Jiayuan1，GU Quliang2，KUAI Yihe1，OU Yitao1，WANG Lijing1，LI Weidong3
（1.Vascular Biology Research Institute；2.School of Basic Sciences；3.School of Health Sciences，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To explore the suppression of traditional Chinese medicine triptolide on breast cancer cells.Methods Human breast cancer MDA-MB-231and MCF-7 cells were treated with different concentrations of triptolide for 24 h.Phospholipase D1 PLD1 and c-Myc proteins were examined by western blot.c-Myc mRNA was examined by RT-PCR.Results Triptolide inhibited the proliferation of both breast cancer cells and down-regulated the expression of PLD1 and c-Myc in MDA-MB-231 cells. Conclusion Triptolide can suppress the proliferation of MDA-MB-231 and MCF-7 cells.

Key wordstriptolide breast cancer cells PLD1