急性胰腺炎相关性肺损伤小鼠肺组织蛋白组学初步研究

冼慧仪，卢心鹏2，曹志3，陈鸿生2，李风雷，廖东江2



急性胰腺炎相关性肺损伤小鼠肺组织蛋白组学初步研究

冼慧仪1，卢心鹏2，曹志3，陈鸿生2，李风雷1，廖东江2

（1.广州医学院荔湾医院，广东广州510120；2.呼吸疾病国家重点实验室，广东广州510230；3.华南师范大学药物研究院，广东广州510631）

摘要：目的应用蛋白质组学方法筛选急性胰腺炎相关性肺损伤（APALI）小鼠模型与正常小鼠肺组织蛋白质表达差异，为阐明APALI的发病机制和预后提供理论依据。方法20只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，实验组通过腹腔注射雨蛙肽的方法造模，造模后处死小鼠取左肺组织进行病理学分析，右肺组织提取肺组织总蛋白，用双向电泳加质谱的技术路线进行蛋白质组学分析。结果分析差异蛋白质功能，发现差异蛋白质主要与炎症反应及氧化还原相关。结论炎症浸润、组织细胞损伤引起的氧化应激损伤可能在APALI发病早期扮演重要角色，在APALI早期重视抗氧化治疗可有助于改善预后。

关键词：急性胰腺炎相关性肺损伤；动物模型；蛋白质组学

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是以自体胰腺消化和胰腺坏死为主要特征的一种全身性疾病，该病具有病程进展极快、并发症多和病死率高等特点。APALI是AP最常见的并发症，其发生率可高达65%左右，继发急性呼吸窘迫综合征达20%左右，是急性胰腺炎患者早期死亡的重要原因［1］。有

网络出版时间：2016-05-30 11：07 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1107.007.html研究认为中性粒细胞激活、胰酶、氧化损伤、细胞因子、补体系统、激肽、一氧化氮、内皮素及炎症介质等因素的相互作用与影响在急性胰腺炎相关性肺损伤（acute pancreatitis-associated 1ung injury，APALI）发病中起着重要的作用［2］。目前由于APALI的相关发生机制尚不明确，导致临床治疗也缺少有效的治疗方案，因此迫切需要明确其损伤机制。本研究应用蛋白质组学的相关技术，分析APALI小鼠模型肺组织与正常小鼠肺组织差异表达蛋白质与APALI发病的关系，从蛋白质表达水平初步阐明APALI的发生机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性BALB/c小鼠20只，体质量16～18 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK（湘）2011-0003。小鼠随机分配为实验组和对照组，每组10只。

1.2 主要试剂

Bradford蛋白定量试剂盒、pH固相梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL，17 cm）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、载体两性电解质（pharmalyte，pH3～10）、碘乙酰胺、过硫酸铵（APS）均为Bio-Rad公司产品；尿素（Urea）、二硫苏糖醇（DTT）、CHAPS、SDS、TEMED、Tris碱（Tris-base）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硫脲（Thiourea）、三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羟基肉桂酸（CCA）、戊巴比妥钠、雨蛙肽（Caerulein）均为Sigma公司产品；无水乙醇、95%（φ）乙醇、苏木素染液、伊红染液、盐酸、TO、中性树胶、考马斯亮蓝R-250等购自广州化学试剂厂。

1.3 主要仪器

RM2245切片机、DM4000B荧光显微镜（Leica公司）；IPGphor等电聚焦仪、proteanⅡxi cell垂直电泳槽、Image ScannerⅡ透射扫描仪（Bio-Rad公司）；Imagemaster 2D 5.0图像分析软件（GE公司）；4800 PLUS MALDI-TOF-TOF质谱仪（AB SCIEX公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 APALI小鼠模型造模及肺组织标本采集

APALI小鼠模型造模采用Craig等［3］的方法，禁食过夜后分别用10 mg/kg剂量的雨蛙肽和生理盐水腹腔注射小鼠，每小时注射1次，共8次，首次注射24 h后结束动物实验。动物实验结束后用致死剂量的戊巴比妥钠腹腔注射处死小鼠，快速采集小鼠的肺组织备用。

1.4.2 小鼠肺组织病理标本的处理及HE染色 将新鲜的小鼠左肺组织用生理盐水冲洗后，于4%（φ）多聚甲醛固定液中固定48 h，然后用0.01 mol/L PBS液洗涤3次；梯度酒精（70%～100%）进行脱水，共20～30 h；二甲苯透明20～40 min，60℃石蜡浸润4～4.5 h，最后用石蜡包埋。将包埋好的组织石蜡块进行常规肺组织切片（5 μm厚），捞于玻片上，60℃干燥箱干燥24 h。TO 10 min，2次，苏木素染色1 min，1%（φ）盐酸酒精脱色10 s，流水冲洗10 min，伊红染色10 s，流水冲洗10 min，55℃烘20 min后用中性树胶封片。

1.4.3 肺组织总蛋白的制备 将小鼠右肺组织用预冷PBS反复冲洗，去除血液并剪去多余结缔组织及脂肪组织，吸干组织表面水分。每组10只小鼠肺组织各取0.5 g混合在一起后剪碎，移入预冷的玻璃匀浆器中加入裂解缓冲液（7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）匀浆；冰上静置30 min，4℃17 000 g/min离心60 min，取上清即为总蛋白质。用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白质的浓度。

1.4.4 双向凝胶电泳 双向电泳参照Görg等［4］的方法进行。第一相等电聚焦（IEF），取850 mg小鼠肺组织蛋白，上样量总体积为0.35 mL。30 V主动水化12 h后进行等电聚焦，等电聚焦的总伏小时数为80 000 Vh。等电聚焦结束后，迅速取出IPG胶条，分别进行2次平衡，各15 min。将平衡好的胶条转入垂直电泳槽中进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件：10 mA电流恒流每块胶电泳30 min，然后每胶25 mA，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。凝胶用考马斯亮蓝R-250染液染色后扫描，得到的双向电泳图谱通过ImageMaster 2D Elite 5.0图像分析软件进行分析。

1.4.5 质谱分析 沿边缘切取凝胶上的差异蛋白质点（表达量差异在2倍以上），置于EP管内。用含50 mmol/L碳酸氢铵的 50%（φ）乙腈脱色20 min，乙腈脱水，加入5 μL的胰蛋白酶（12.5 ng/μL）于冰上吸涨后，加入20 μL的覆盖液（含50 mmol/L碳酸氢铵的10%乙腈）于37℃过夜。吸出上清转移到新EP管，真空冻干。然后将干燥的肽段重新溶解于CHCA溶液（0.5 g/L，由0.1%TFA和50% CAN配制）中，与基质混合点到不锈钢MALDI靶板上作质谱分析。MALDI-TOF-MS质谱分析采用正离子反射模式，用ABI 4700 Calibration Mixture作为外标校正，扫描范围为800～4 000。从一级质谱的肽质量指纹图谱中选择信噪比（signal-to-noise ratio，S/ N）大于50的5个得分最高的8个前体离子作MS/ MS分析，质谱信号累计扫描1 500次。

1.5 数据库检索

数据用 GPS Explorer软件（V3.6，Applied Biosystems）在NCBI数据库搜库。检索条件：物种来源为小鼠，肽片段分子量最大容许误差控制±0.3 u，酶解片段不完全选择为1个，离子选择［M+H］和monoisotopic，固定修饰为半胱氨酸碘乙酰胺化，可变修饰为蛋氨酸氧化。

2 结果

2.1 两组小鼠肺组织HE病理片结果

见图1。对照组小鼠肺组织镜下结构清晰，上皮、内皮细胞结构正常，血管无充血，间质无渗出、增厚，无明显炎性细胞浸润。模型组小鼠肺组织镜下可见大片肺组织间质水肿，血管充血，肺泡腔内大量渗出，肺泡间隔增厚，伴大量中性粒细胞浸润。提示动物APALI模型成功建立。

A.对照组；B.APALI模型组。图1 肺组织HE病理切片（20×）Figure 1 Pathological examination of mouse lung tissue by H-E staining（20×）

2.2 小鼠肺组织双向凝胶电泳图谱分析

通过双向电泳技术获得了分辨率高、重复性好的对照组小鼠与APALI模型小鼠肺组织双向凝胶电泳图谱（图2）。分析同一样本的3块胶，相同蛋白质点在不同胶的位置上有较好的重复性，从而建立了重复性较好的对照组小鼠与APALI模型小鼠肺组织双向凝胶电泳图谱。对照组小鼠与APALI模型小鼠肺组织分别有（1 135±50）个点和（1 027±50）个点得到分离，对照组匹配点数为（985±20）个，APALI模型组匹配点数为（918±15）个，其平均匹配率分别为86.7%和89.3%。对斑点位置进行重复性检测，在IEF方向的平均偏差为（1.05±0.17），SDSPAGE方向的平均偏差为（1.15±0.23），选取各组重复胶中均有相同变化且表达量相差2倍以上的蛋白质点为差异表达蛋白质，结果共有32个差异表达的蛋白点，其中30个蛋白点在实验组中表达上调，2个蛋白点在实验组中表达下调（6号和22号点）。

A.对照组；B.APALI模型组（图中标记1-32点为在两组中高表达的蛋白质点，与表1中鉴定的蛋白质点编号相对应）。图2 小鼠肺组织双向凝胶图谱Figure 2 2-DE of mouse lung tissue

2.3 差异蛋白质点MALDI-TOF-MS的鉴定

对差异表达蛋白质进行质谱分析及数据库检索，共获得了28个蛋白质信息，9号、13号及30号蛋白质点未鉴定出（见表1、图2）。

2.4 差异蛋白质功能分析

经检索，差异表达蛋白功能涉及氧化还原、细胞骨架变化、胞内异常蛋白降解及能量代谢等过程，提示APALI发病过程中肺组织可能存在氧化应激加重、组织细胞异常蛋白合成增加及能量代谢异常等改变。

3 讨论

蛋白质组学概念的提出及其研究技术的迅速发展，为人们从蛋白质整体水平上寻找疾病相关分子标志物和治疗靶点成为现实。蛋白质组学在免疫、肿瘤形成等方面已经取得了重大进展，在APALI研究尚处于初期阶段。目前APALI发病机制的研究还主要集中于细胞因子和趋化因子，例如TNF-α、IL-1β、CINC/IL-8、CCR1、MIF（IL-18、IL-10）等在APALI病理过程中募集炎症细胞介导炎症反应的研究［5-7］。而在蛋白质表达水平上系统地对APALI进行蛋白质组学研究未见报道。

本研究以APALI小鼠模型肺组织为研究对象进行蛋白质组学的研究。成功构建了APALI与正常肺组织的2-DE图谱，通过质谱分析和数据库检索，初步筛选出28种可能与APALI发病机制密切相关的蛋白质。其中热休克蛋白27（heat shock protein，HSP）、TCP1伴侣蛋白、蛋白酶体活化复合体、蛋白酶体α4亚单位、泛素结合酶等主要参与细胞内保护稳定正常蛋白、修复或降解异常蛋白等生化过程，在细胞受到有害刺激时可帮助维持细胞稳态，并参与细胞周期调控［8-9］。APALI发生时，肺组织存在广泛炎症浸润尤其是中性粒细胞浸润。活化的炎性细胞分泌大量蛋白酶、炎症因子等，可导致肺组织细胞（内皮细胞、肺泡上皮细胞等）发生损伤，这些刺激因素可能导致细胞产生大量异常蛋白，诱导了分子伴侣蛋白和蛋白酶体相关蛋白、泛素结合酶等的应激性表达上升［8］。凝溶胶蛋白和胶转蛋白参与细胞骨架的调节，也可调控细胞运动和凋亡，同时对T细胞免疫活力的维持也有重要作用［10-11］。APALI发病过程中，大量炎症细胞被募集移行到肺组织，局部肺组织细胞大量凋亡，这些过程均涉及细胞骨架的剧烈变化［10-11］，可能引起凝溶胶蛋白和胶转蛋白表达显著上升。NADH-泛醌还原酶、UMP-CMP蛋白激酶、a-异柠檬酸脱氢酶、左旋乳酸脱氢酶、SEC14L3等则主要参与生物氧化、三羧酸循环、氧化磷酸化反应、氧化呼吸链、糖酵解和糖异生，可能反映了肺损伤状态下肺组织细胞存在能量代谢异常［13］，并导致能量代谢相关酶的代偿性表达上升［14］。Prx6（过氧化物酶6）有抗氧化和清除自由基的作用，在抗氧化应激中有重要作用，同时还有PLA2活性，参与肺表面活性物质的代谢［7］。其表达的增加也提示APALI发病后肺组织氧化应激加重，导致相关抗氧化酶代偿性增强。

表1 差异表达蛋白质点检索结果Table 1 Identification and characterization of proteins by MS

从本研究发现的差异蛋白功能类型来看，肺组织炎症浸润、组织细胞损伤是APALI重要病理过程，使肺组织处于高耗能、高代谢状态。浸润炎性细胞的各种活性分泌物及损伤细胞的死亡解体，会显著加重肺组织的氧化应激负荷，在急性期诱导相关抗氧化酶的代偿性表达。大量研究表明，氧化损伤在急性肺损伤中扮演重要角色，本研究结果表明氧化损伤在APALI发病早期也扮演重要角色，在APALI早期重视抗氧化治疗或有助改善预后。

通过对APALI小鼠模型肺组织的蛋白质组研究发现，在APALI造模过程中许多蛋白参与病理生理变化，大范围的炎症浸润可能导致了广泛的肺组织细胞损伤，同时引起局部氧化应激加重，影响机体的预后。因此，全面了解APALI蛋白质表达变化的情况及生理功能作用机制，为APALI患者临床治疗、预后提供理论依据和实践基础。

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（责任编辑：幸建华）

中图分类号：R657.5+1

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0374-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041402

收稿日期：2016-04-14

作者简介：冼慧仪（1981—），女，硕士，主要从事呼吸内科学临床及基础研究，Email：xianhuiyi1111@163.com；通信作者：廖东江（1979—），男，助理研究员，主要从事蛋白质组学研究，Email：liaodongjiang79@163.com。

Proteomics analysis of acute pancreatitis-associated lung injury in mice

XIAN Huiyi1，LU Xinpeng2，CAO Zhi3，CHEN Hongsheng2，LI Fenglei1，LIAO Dongjiang2
（1.Liwan Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510120，China；2.State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou 510230，China；3.Institute of Pharmaceutical Research，South China Normal University ，Guangzhou 510631，China）

AbstractObjective To screen the differentially expressed proteins of lung tissue between acute pancreatitis-associated lung injury APALI mice and wild type wt mice by using proteomics methods which may provide an evidence for study of the pathogenesis and prognosis of APALI.Methods 20 BALB/ c mice were randomly divided into the experimental and control groups.Caerulein was injected intraperitonealy to establish the APALI model.Mice were sacrificed after one day of caerulein injection and left lung was collected for pathology examination.Total proteins from right lung were extracted for 2-DE and proteomics research.The differentially expressed protein spots were identified to explicit the biological functions.Results The lung-injury symptoms were observed in experimental mice.The differentially expressed proteins were closely related to inflammatory and redox reactions.Conclusion Oxydative stress induced by inflammatory infiltration and tissue injury is crucial in the early development of APALI. Antioxydant treatment in the early stage may be helpful for prognosis of APALI.

Key wordsAPALI；animal model；proteomics