高效液相色谱法测定生化汤协定方代煎液中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量

汪　怡

(江苏省昆山市中医医院临床药理科，江苏　昆山　215300)



制剂与质量控制

高效液相色谱法测定生化汤协定方代煎液中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量

汪怡

(江苏省昆山市中医医院临床药理科，江苏昆山215300)

【摘要】目的建立高效液相色谱法(HPLC法)测定生化汤协定方代煎液中游离阿魏酸和总阿魏酸含量的方法。方法应用HPLC法测定游离阿魏酸和总阿魏酸的含量，以Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱，甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)为流动相，检测波长为321 nm。结果游离阿魏酸在进样量0.212～1.060 μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=4.685 5×106X-2.109 0×104(r=0.999 9)，游离阿魏酸平均加样回收率100.60%，相对标准偏差(RSD)=2.33%，总阿魏酸平均加样回收率99.43%，RSD=2.65%。结论本方法操作简单，方法可靠，结果准确，灵敏度高，重现性好。

【关键词】色谱法，高压液相；生化汤；阿魏酸

生化汤出自《傅青主女科》，是治疗妇产科疾病特别是产后疾病的名方。全方由当归、川芎、桃仁、炮姜、炙甘草组成。我院根据多年临床经验，在此基础上添加益母草组成生化汤协定方应用于临床，效果显著。为方便住院患者服用，多以煎药机代煎形式服务于临床。本试验采用高效液相色谱法(HPLC法)测定生化汤协定方代煎液(以下简称代煎液)中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量，为进一步研究质量控制方法提供科学依据。

1材料与方法

1.1仪器与试药

1.1.1仪器LC-2000高效液相色谱仪(上海天美科学仪器有效公司)，LC-2030 紫外可见分光光度计(上海天美科学仪器有效公司)；FA2004N电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；YFY-20型中药煎药机(北京东华原医疗设备有限责任公司)；YBS-150型中药汤剂包装机(北京东华原医疗设备有限责任公司)。

1.1.2药品及试剂阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110773-200611)；川芎、当归、桃仁、炮姜、甘草、益母草药材来自我院药房；甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷(分析纯，上海申翔化学试剂有限公司)，氢氧化钠(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1色谱条件色谱柱：Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)；流速：1.0 mL/min；检测波长：321 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在选定的条件下，代煎液样品中阿魏酸色谱峰与代煎液样品中其他组分色谱峰基线分离，按阿魏酸峰计算，理论板数(N)为4 000以上。同时取阴性对照品溶液进样，结果表明阴性对照品溶液在阿魏酸色谱峰位置处无相应峰出现。阴性对照品溶液、对照品溶液、代煎液样品溶液HPLC图见图1～3。

图1　阴性对照品溶液HPLC图

图2 　对照品溶液HPLC图

图3　代煎液样品溶液HPLC图

1.2.2溶液制备

1.2.2.1对照品溶液制备取阿魏酸对照品约5 mg，精密称定，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得(每1 mL含阿魏酸对照品0.212 mg)。

1.2.2.2供试品溶液制备①代煎液制备：按处方量称取药材，加适量水，浸泡30 min，于中药煎药机中煎煮40 min，滤出药汁，用中药汤剂包装机打包，每剂2袋，每袋150 mL，备用。②游离阿魏酸供试品溶液制备：量取代煎液100 mL，用三氯甲烷200 mL振摇提取4次，每次50 mL，合并三氯甲烷液200 mL，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀静置。用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。③总阿魏酸供试品溶液制备：量取代煎液100 mL，加入氢氧化钠1 g，超声提取1 h，用盐酸调节pH至2～3，再用三氯甲烷200 mL振摇提取4次，每次50 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀静置。用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

1.2.2.3阴性对照品溶液制备按处方量制成缺川芎、益母草的阴性模拟制剂，按1.2.2.2项下方法制成阴性对照品溶液。

1.3线性关系考察精密吸取上述对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取10 μL，分别注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积，以进样量对峰面积值进行回归分析，以进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。

1.4精密度试验精密吸取同一对照品溶液，重复进样5次，测定阿魏酸峰面积，计算相对标准偏差(RSD)。

1.5稳定性试验取同一代煎液溶液，按1.2.2.2项下方法分别制备游离阿魏酸和总阿魏酸供试品溶液，并分别于0、2、4、6、8 h进样，测定样品中阿魏酸峰面积，计算RSD。

1.6重复性试验取相同批号药材煎煮5份代煎液溶液，按1.2.2.2项下方法分别制备游离阿魏酸和总阿魏酸供试品溶液各5份，测定样品中阿魏酸峰面积，计算RSD。

1.7回收率试验

1.7.1游离阿魏酸回收率试验取已知含量代煎液50 mL，各5份，根据加样回收率试验1∶1加入方法，精密加入已配置好的阿魏酸对照品溶液各1 mL，加蒸馏水定容至100 mL，按1.2.2.2项下游离阿魏酸供试品溶液制备方法制备供试品溶液，计算游离阿魏酸的回收率。

1.7.2总阿魏酸回收率试验取已知含量代煎液50 mL，各5份，根据加样回收率实验1∶1加入方法，精密加入已配置好的阿魏酸对照品溶液各1 mL，加蒸馏水定容至100 mL，按1.2.2.2项下总阿魏酸供试品溶液制备方法制备供试品溶液，计算总阿魏酸的回收率。

1.8样品含量测定取3批代煎液，按1.2.2.2项下方法分别制备游离阿魏酸和总阿魏酸供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算样品中游离阿魏酸和总阿魏酸含量。

2结果

2.1线性关系考察回归方程为Y=4.685 5×106X-2.109 0×104，r=0.999 9。说明阿魏酸在进样量0.212～1.060 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2精密度试验RSD=1.00%，说明精密度良好。

2.3稳定性试验 RSD分别为2.70%和2.41%。说明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.4重复性试验游离阿魏酸平均含量2.45 μg/mL，RSD=1.15%；总阿魏酸平均含量4.23 μg/mL，RSD=2.06%。说明方法的重复性较好。

2.5回收率试验

2.5.1游离阿魏酸回收率试验平均回收率=100.60%，RSD=2.33%。说明该方法具有良好的回收率。见表1。

表1　游离阿魏酸回收率试验

2.5.2总阿魏酸回收率试验平均回收率=99.43%，RSD=2.65%。说明该方法具有良好的回收率。见表2。

表2　总阿魏酸回收率试验

2.6样品含量测定见表3。

表3　样品含量测定

3讨论

川芎是生化汤中主要药物，其有效成分为阿魏酸，同时还存在阿魏酸松柏酯，其中阿魏酸松柏酯在中性、强酸或碱性条件下，可以水解生成阿魏酸，即使水浴加热都可能不同程度的发生，Lu GH等[2]提出了游离阿魏酸和总阿魏酸的概念，认为游离阿魏酸是指在植物体中本来就含有的那部分阿魏酸，总阿魏酸是游离阿魏酸和其他途径分解生成的阿魏酸之和，并认为在用化学分析方法评价中药质量时，应优先采用总阿魏酸的含量作为评价指标，故本试验对代煎液中游离阿魏酸和总阿魏酸[3-5]的含量进行测定，从而为代煎质控研究提供科学依据。在阴性对照品溶液的制备中，由于单纯去除川芎的阴性溶液在阿魏酸峰处存在干扰，后查阅文献，发现益母草药材中也存在少量阿魏酸[6]，故去除川芎和益母草来制备阴性对照品溶液。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版：一部[M].北京：化学工业出版社，2010：38.

[2]Lu GH，Chan K，Leung K，et al.Assay of free ferulic acid and total ferulic acid for quality assessment of Angelica sinensis [J]．J Chromatogr A，2005，1068(2)：209-219.

[3]夏荃，文惠玲，李土光，等.高效液相色谱法测定川芎不同炮制品中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量[J].广州中医药大学学报，2009，26(4):384-387.

[4]吕光华，程世琼，陈金泉，等.HPLC测定川芎药材和饮片中游离阿魏酸和总阿魏酸的含量及其质量评价指标[J].中国中药杂志，2010，35(2)：194-198.

[5]徐自升，蔡宝昌，张弦，等.中药川芎中阿魏酸稳定性的研究[J].现代中药研究与实践，2004，18(2)：25-27.

[6]罗毅，罗云，周本宏，等.益母草中阿魏酸的分离和色谱鉴定[J].广东药学院学报，2004，20(5):462-463.

(本文编辑：习沙)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.02.033

作者简介：汪怡(1981—)，女，主管中药师，硕士。从事中药制剂工作。

【中图分类号】R284.1；R286.0

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)02-0265-04

(收稿日期：2014-06-03)

Determination of free and total ferulic acid in decoction of Shenghua prescription by HPLC

WANGYi.

DepartmentofClinicalPharmacology,KunshanCityHospitalofTraditionalChineseMedicineinJiangsuProvince,Kunshan,Jiangsu215300

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for determination of free and total ferulic acid in decoction of Shenghua prescription by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods On Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); with methyl alcohol (containing 1 % acetic acid) = 30∶ 70 as mobile phase and UV determination at 321 nm. Results A good linearity was obtained over the range of 0.212～1.060 μg for free ferulic acid, regression equation was Y=4.685 5×106X-2.109 0×104(r=0.999 9). The average recoveries of free and total ferulic acid components were 100.60% with relative standard deviation (RSD) = 2.33% and 99.43% with RSD = 2.65%, respectively. Conclusion This method is simple, reliable, accuracy, with high sensitivity and better repeatability.

【Key words】Chromatography; High pressure liquid; Shenghua decoction; Ferulic acid