含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

苗巍男，李　瑞，钟　江，郑兆鑫，刘明秋

(复旦大学 生命科学学院，上海 200438)



含FMDV中和表位的重组病毒颗粒的构建及鉴定

苗巍男，李瑞，钟江，郑兆鑫，刘明秋

(复旦大学 生命科学学院，上海 200438)

摘要：针对FMDV的疫苗研究一直是防控口蹄疫的重点，而病毒样颗粒(VLPs)形式的疫苗因其安全性和近似传统灭活疫苗的良好免疫效果，近年来逐渐成为疫苗研究的一个新方向.本实验利用猪圆环病毒PCV2的衣壳蛋白(CAP)作为载体，分别插入FMDV MYA98毒株的抗原表位组合——VP1蛋白上B细胞表位141～160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，构建对应重组杆状病毒，分别命名为reBAC-CAP-B，reBAC-CAP-BTB.将上述病毒颗粒转入Sf9细胞表达，收获重组杆状病毒并再次感染Sf9细胞扩大病毒滴度，获得目的蛋白CAP-B，CAP-BTB，经过SDS-PAGE，Western blot鉴定正确，透射电镜观察到20～30 nm大小的目的颗粒.

关键词:口蹄疫病毒； 猪圆环病毒； 病毒样颗粒； 抗原表位； 杆状病毒-昆虫细胞表达系统

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease， FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)引起的一种偶蹄类动物所患的急性、热性、高度接触性传染病[1].FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，是最小的动物病毒之一.按血清学分类，口蹄疫病毒目前可以分为7种血清型： O、A、C型(欧洲型)，SAT1、2、3型(非洲型)，AsiaⅠ型(亚洲型)；每种血清型内又包含许多亚型[2].不同血清型间不能交叉保护，同一种血清型中不同亚型也有变化，不一定能交叉保护.由于该病传播途径多，传染速度快，并且病毒易变异，已被国际兽医局(OIE)列为A类传染病之首[3]；许多国家尽管投入了大量的人力、物力和财力进行预防和控制，然而该病仍在流行；因此针对口蹄疫预防及治疗的研究一直是一个热点.在我国主要流行的血清型之一是O型FMDV，其中近年来广泛爆发的是MYA98亚型毒株[4].

疫苗免疫是预防FMDV爆发的重要手段之一，可以在疾病暴发时快速诱导免疫动物产生中和抗体，从而保护动物免于病毒感染[5].传统疫苗为灭活疫苗，具有免疫原性高，生产、储存、运输方便等优点，但是灭活不彻底则容易造成散毒，制作过程需要很高的防护措施以防病毒泄露是灭活疫苗的重大缺点[6].近年来随着基因工程和蛋白质工程技术的不断发展，逐渐衍生出基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等新疫苗种类.

其中病毒样颗粒(Virus-Like Particles， VLPs)是一种新兴的具有巨大潜力的疫苗形式.病毒样颗粒即含有一种或多种病毒结构蛋白的空心颗粒，它具有和野生病毒相似的颗粒结构和抗原性，但不含相关病毒基因[7].VLPs具有安全性高(不含病毒核酸)、免疫原性高、结构利于抗原呈递、稳定性好、能作为载体插入外源片段、可以用来区分免疫动物和感染动物等优点[8].目前已有多种公司研发的VLPs形式的疫苗上市销售.VLPs作为疫苗的潜力已被各项研究充分地证明，并且仍拥有着广阔的发展前景和巨大的潜力，在基础研究中也充满着潜力，为科学研究开辟了新的探索领域[9-10].

猪圆环病毒(Procine CircoVirus， PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是迄今为止已知最小的动物病毒[11]，该病毒颗粒无囊膜，呈二十面体结构.其ORF2编码的CAP蛋白是病毒最主要的结构蛋白和免疫原[12]，CAP蛋白C端含有较多的转角结构，位于病毒颗粒表面，因此也是优势抗原表位所在[13].单独CAP蛋白已被证明能组装成病毒颗粒，且能插入外源片段表达，并具有生物活性[14-15]，插入的外源片段最大约为20aa左右.

本实验采用PCV2的外壳蛋白CAP作为载体，在C端插入两种不同的FMDV中和表位组合-MYA98亚型VP1蛋白上B细胞表位141～160aa(B)与串联的B细胞和T细胞表位141～160aa-21～40aa-141～160aa(BTB)，将构建的重组杆状病毒在草地夜蛾Sf9细胞系内扩增并验证了CAP蛋白C端所能容纳的外源片段大小，期望为进一步构建含有FMDV表位的VLPs疫苗奠定基础.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、细胞与质粒

大肠杆菌菌株E.coliDH5α由本实验室保存；草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢细胞Sf9，大肠杆菌E.coliDH10Bac，pFastBac-1载体由复旦大学钟江教授提供.

1.1.2主要试剂

限制性内切酶，T4 DNA连接酶体系购自New England Biolabs公司；pMD-18T试剂盒购自TaKaRa公司；PCR体系(pfu酶，taq酶，PCR buffer，dNTPs等)购自北京天根生化科技有限公司；质粒小量抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司；TNM-FH培养基购自Sigma公司；胎牛血清购自Thermo Fisher公司；Cellfectin Ⅱ转染试剂，购自Invitrogen公司；豚鼠抗FMDV MYA亚型血清来自内蒙古金宇保灵生物药品有限公司；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase， HRP)偶联羊抗豚鼠抗体购自proteintech公司；ECL化学发光显色试剂盒购自GE公司.

表1　实验中使用的引物序列

注： 划线部分为酶切位点.

1.1.3引物和序列

FMDV O型毒株O/BY/CHA/2010(MYA98亚型)VP1上的21～40aa和141～160aa的核苷酸序列(GenBank： JN998085.1)由上海捷瑞生物工程有限公司经由昆虫细胞密码子优化后合成，命名为BTB；PCV2 CAP基因(GenBank： ACZ06084.1)由上海农业科学院畜牧兽医研究所易建中老师提供；实验过程所用引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成，见表1.

1.2方法

1.2.1CAP-B和CAP-BTB基因的克隆

分别从公司合成的含有BTB基因的载体和含有CAP基因的载体上扩增出BTB和CAP基因(使用的引物分别为btb-F/btb-R和cap-F/cap-R)，然后通过重叠PCR(合成的BTB基因N端含有CAP基因C端一部分序列)获得CAP-BTB序列(使用的引物为cap-F/btb-R)，测序确认.再利用cap-F/b-R引物从测序正确的CAP-BTB序列上扩增出CAP-B序列，测序确认后分别保存.

1.2.2质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB的构建

将CAP-B基因和pFastBac1载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收后进行连接，将连接产物转入感受态E.coliDH5α后，挑取阳性克隆测序确认，抽取质粒并命名为pFB-CAP-B；同样方法获得pFB-CAP-BTB.

1.2.3重组杆状病毒质粒reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB的获得

分别将质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB转化入E.coliDH10 Bac感受态细胞内，借由质粒上的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上.经由抗生素(卡那霉素，四环素，庆大霉素)和蓝白斑筛选后，提取重组杆状病毒质粒，分别利用目的基因的特异性引物和载体上的M13通用引物进行PCR鉴定，分别命名为reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB.

1.2.4重组病毒样颗粒的表达

将2种重组杆状病毒质粒分别转染至对数期Sf9昆虫细胞，当细胞出现明显病变时，收获培养基上清，500g离心5～10min收取上清，即为P1代毒株；再用P1代毒株感染细胞获得滴度较高的P2代毒株；P2代毒株再次感染细胞(MOI=1～5)即可表达重组病毒样颗粒，分别命名为CAP-B和CAP-BTB.

1.2.5SDS-PAGE及Western blot鉴定

用P2代感染细胞，当有明细病变时，收获细胞，PBS洗2次，500g离心5～10min收获细胞沉淀，加入SDS-PAGE loading Buffer混匀后进行SDS-PAGE验证.同时电转硝酸纤维素膜进行Western blot鉴定，用含5% 脱脂奶粉的PBST(含0.1% Tween-20的PBS)封闭液封闭2h，加入按效价稀释的豚鼠抗FMDV MYA98亚型血清的一抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗豚鼠IgG二抗孵育1h，PBST洗3次，每次5min；使用ECL化学发光试剂盒进行显色分析.

1.2.6透射电镜观察VLPs形态

将P2代感染后的细胞经过超声波破碎，离心后取沉淀样品少许溶于PBS制成悬浮液，滴在载样铜网上，使用2%的磷钨酸负染3～5min，吸去多余液体，室温干燥后使用透射电镜(TEM)进行观察.

2结果与分析

2.1CAP，BTB及重组基因CAP-B，CAP-BTB扩增产物的鉴定

CAP和BTB基因全长分别为705bp和243bp，分别用cap-F/cap-R和btb-F/btb-R引物进行扩增后，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图1(a)，条带大小均正确.CAP和BTB基因在CAP基因C端重叠21bp，利用引物cap-F/btb-R通过重叠PCR获得CAP-BTB基因，全长为930bp，再用cap-F/b-R引物从CAP-BTB基因上扩增出CAP-B序列，全长为771bp，电泳分析结果均正确(图1(b),(c)).所有结果均测序并比对标准序列确认.

2.2重组杆状病毒质粒的构建及鉴定

挑选转座后白斑抽取重组杆状病毒质粒，分别获得reBAC-CAP-B和reBAC-CAP-BTB；分别利用M13引物(杆状病毒质粒上自带引物，见图2(a)(见第384页))和序列对应的特异性引物进行PCR鉴定；M13引物PCR产物理论大小分别为3100bp和3200bp，特异性引物PCR产物结果分别为771bp和930bp，结果见图2(b)、(c)(见第384页)，均在目的大小位置看到对应条带，说明重组杆状病毒质粒构建成功.

2.3重组杆状病毒毒株的获得

用rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB分别转染sf9细胞，3～4d后细胞停止生长，体积变大，内部出现颗粒体(小泡)，晚期细胞脱落或破碎，大量死亡；阴性对照组细胞正常生长，说明重组病毒转染成功，见图3(见第384页)(结果未完全列出).待细胞大部分明显病变后收获病毒毒株，即P1代毒株，用于接下来的扩增.

2.4重组病毒样颗粒的SDS-PAGE和Western blot结果

使用P2代毒株感染细胞，收获细胞进行SDS-PAGE鉴定.根据软件预测， CAP-B蛋白约为30kD，CAP-BTB约为36kD.如图4(a)，各样品在预计大小位置有明显目的条带，且阴性对照空细胞和空载体在相应位置无明显条带，说明目的蛋白成功表达.

使用豚鼠抗FMDV MYA98亚型血清作为一抗进行Western blot，在CAP-B和CAP-BTB实验组均可以观察到特异性条带(图中向下箭头指示位置)，而阴性对照均无对应条带，见图4(b).图中除目的条带位置处有其他条带，是因为所用一抗为多抗造成的非特异性杂带，没有特异性条带反应强烈，不影响实验结论.结果说明表达的重组病毒样颗粒均具有良好的免疫反应性.

2.5重组病毒样颗粒的电镜观察

表达的2种重组VLPs样品经过磷钨酸负染后，在透射电镜下观察结构.PCV2病毒颗粒大小理论上直径为17～20nm，预估插入了外源片段后，CAP-B的大小为20～25nm，CAP-BTB大小为20～30nm.图5中可见，观察到的颗粒与预测大小一致，证明了重组病毒形成了VLPs结构.图中有些较大的颗粒可能是多个蛋白聚在一起没分开导致的，属于正常现象.

3讨论

多种病毒，包括包膜病毒、无包膜病毒、人类病毒、植物病毒、动物病毒等均已证明在各种表达系统中内能正常表达并正确组装成颗粒结构[16-17].杆状病毒-昆虫细胞表达系统具有安全性好、可容纳的外源片段大、表达效率较高、蛋白质翻译后修饰与哺乳动物细胞类似等优点[18-19].Invitrogen公司的bac-to-bac系统就是采用这一体系的转座子介导的杆状病毒-昆虫细胞重组系统.目前已有多种利用该系统表达的VLPs疫苗正式上市.因此本实验采用昆虫细胞系统表达目的蛋白.

PCV2的ORF2编码的CAP蛋白是其最主要的结构蛋白，已被证明在不同表达体系中均能正确折叠成天然颗粒结构，且有一定的容纳外源片段(约20aa)的能力[14-15].理论上，在C端插入的序列是暴露或者部分暴露在VLPs颗粒的表面，所以对结构的形成影响不大.目前关于FMDV的VLPs研究多使用P1-2A-3C形式构建完整FMDV病毒颗粒，也有在其他病毒外壳蛋白插入结构蛋白或表位的构建方式[20-22].研究表明，FMDV复合多表位组合可诱导强烈的免疫反应，其中VP1蛋白上的21～40aa为常见的T细胞表位[23]，141～160aa位于暴露在表面的G-H环区域，是常见的经典B细胞表位之一[24].因此本实验采用在C端插入两种不同表位组合(单表位和三表位串联)的不同方式构建重组VLPs，成功获得重组毒株并表达蛋白CAP-B，CAP-BTB，在预期蛋白质大小位置分别可看到对应的条带，并且在使用口蹄疫病毒血清的Western blot实验中CAP-B，CAP-BTB都有免疫反应，证明了表达的蛋白具有免疫反应性.在电镜观察结果中看到重组VLPs均形成了颗粒状结构，近似天然病毒.说明重组病毒具备形成颗粒结构的能力，PCV2 VLPs能容纳长达70aa的外源片段.

理论上杆状病毒-昆虫细胞系统表达的外源性蛋白应该可溶，大部分的实验也证明了这点.但是本实验提取的重组病毒样颗粒均不溶于缓冲溶液(PBS，TNE等溶液)中，即使在裂解细胞时采取了超声破碎、反复冻融、细胞裂解液等办法，但是蛋白仍然存在于裂解后离心下来的沉淀中.对重组病毒样颗粒的等电点进行分析，中和缓冲液pH有一定的差距；且重组病毒样颗粒上无核定位和膜定位信号，因此理论上不会形成膜融合蛋白或者核内蛋白.蛋白质的溶解情况可能与蛋白质本身性质、表达量、裂解条件有一定的关系.大部分的研究本身表达的蛋白均可溶，因此对不溶的情况研究较少，杨林等在2000年对昆虫细胞表达的GST融合蛋白的可溶性进行了一定研究，发现本身不溶的蛋白在提高裂解液非离子去垢剂(如Triton-X100)浓度以及加入十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)后有约20%～30%的蛋白质变为可溶[25].Crisci等在2012年利用该系统表达VLPs时，裂解细胞时分别加入了DNase Ⅰ和Sarkosyl处理[22]，研究本身并未提及表达的VLPs是否存在不溶的情况，但是这些处理方式为以后的实验改进提供了新的方向.此外也可以考虑更换细胞系，如高表达量的High Five、哺乳动物细胞等，或者引入引导序列使得蛋白质可以分泌表达等方法.

本实验构建了含有FMDV抗原表位的重组病毒颗粒载体，并表达了具有免疫反应性及能够形成颗粒结构的重组VLPs，验证了PCV2 CAP蛋白在C端插入了70aa的外源片段后仍能形成VLPs，为进一步利用该载体表达多表位抗原奠定了基础.虽然存在着蛋白质不可溶的问题，但可以考虑直接加入佐剂进行动物实验检测免疫效果，同时尝试着更换条件以期望得到可溶的蛋白质.

参考文献：

[1]MARVIN J G, BARRY B. Foot-and-mouth disease [J].ClinMicrobiolRev, 2004，17(2)： 465-493．

[2]雷连成,陈伟.家畜口蹄疫研究进展 [J].中国预防兽医学报,2001,23(4)： 77-80．

[3]殷震，刘景华．动物病毒学 [M].北京： 科学出版社，1985： 395-414．

[4]PATON D J, KING D P, KNOWLES N J,etal. Recent spread of foot-and-mouth disease in the Far East [J].VetRec, 2010,166(18)： 569-570．

[5]FRENKEL H S. Research on foot-and-mouth disease. Ⅱ. The cultivation of the virus on a practical scale in explantation bovine tongue epithelium [J].AmJVetRes, 1951,17(3)： 224-228．

[6]DOEL T R. FMD vaccines [J].VirusRes, 2003,91(1)： 81-99．

[7]JOHNSON J E, CHIU W. Structures of virus and virus-like particles [J].CurrOpinStructBiol, 2000,10(2)： 229-235．

[9]HAO X, SHANG X, WU J,etal. Single-particle tracking of hepatitis B virus-like vesicle entry into cells [J].Small, 2011,7(9)： 1212-1218．

[10]KACZMARCZYK S J, SITARAMAN K, YOUNG H A,etal. Protein delivery using engineered virus- like particles [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,108(41)： 16998-17003．

[11]TISCHER I, RASCH R, TOCHTERMANN G. Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines [J].Eentralbb,BakteriolOrigA, 1974,226(2)： 153-167．

[12]NAWAGITGUL P, MOROZOV I, BOLIN S,etal. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein [J].JGenVirol, 2000,81(1): 2281-2287．

[13]NAWAGITGUL P, HARMS P A, THAEKER B J,etal. Modified indicret Porcine circovirus(PCV) type2 based and recombinant capsid protein (ORF2)- based enzyme linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV [J].ClinDiagnLabImmunol, 2002,9(1)： 33-40．

[14]BEACH N M, MENG X. Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus type 2(PCV2) [J].VirusResearch, 2012,164(1/2)： 33-42.

[15]LI W, WANG X, BAI J,etal. Construction and immunogenicity of recombinant porcine circovirus-like particles displaying somatostatin [J].VeterinaryMicrobiology, 2013,163(1/2)： 23-32.

[16]KUSHNIR N, STREATFIELD S J, YUSIBOV V. Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform： Diversity of targets and production systems and advances in clinical development [J].Vaccine, 2012,31(1)： 58-83.

[17]GRGACIC E V, ANDERSON D A. Virus-like particles： Passport to immune recongnition [J].Methods, 2006,40(1)： 60-65.

[18]MENA J A, KAMEN A A. Insect cell technology is a versatile and robust vaccine manufacturing platform [J].ExpertReviewofVaccines, 2011,10(7)： 1063-1081.

[19]LIU F, WU X, LI L,etal. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles： Successes and challenges [J].ProteinExpressionandPurification, 2013,90(2)： 104-116.

[20]GUO H C, SUN S Q, JIN Y,etal. Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs, swine and cattle [J].VetRes, 2013,44(1)： 48-60.

[21]SUBRAMANIAN B M, MADHANMOHAN M, SRIRAMAN R,etal. Development of foot-and- mouth disease virus(FMDV) serotype O virus-like-particles(VLPs) vaccine and evaluation of its potency [J].AntiviralResearch, 2012,96(3)： 288-295.

[22]CRISCI E, FRAILE L, MORENO N,etal. Chimeric calicivirus-like particles elicit specific immune responses in pigs [J].Vaccine, 2012,30(14)： 2427-2439.

[23]张中旺,张永光.抗原表位的研究方法及口蹄疫病毒抗原表位的研究进展 [J].微生物学通报,2008,35(8)： 1302-1310.

[24]PFAFF E, MUSSGAY M, BOHM H O,etal. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus [J].EMBOJ, 1982,1(7)： 869-874．

[25]杨林,李国清,黄葆英,等.GST融合蛋白在杆状病毒系统中表达的可溶性研究 [J].中国病毒学,2000，15(2)： 48-53.

文章编号：0427-7104(2016)03-0381-07

收稿日期：2015-07-28

基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金；上海市科学技术委员会项目(13DZ2252000)

作者简介：苗巍男(1992—)，男，硕士研究生；刘明秋，女，副教授，通讯联系人，E-mail： liumq@fudan.edu.cn.

中图分类号：Q 78

文献标志码：A

Construction and Identification of Recombinant Virus-like Particles Fused with Neutralizing Epitopes of FMDV

MIAO Weinan， LI Rui， ZHONG Jiang， ZHENG Zhaoxin， LIU Mingqiu

(SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Abstract：The study on vaccine of FMDV is always a hot spot in world. Recent years, VLPs became a new direction of vaccine study, for its safety and good ability of protection against virus compared to traditional vaccines. Two kinds of neutralizing epitopes of type O FMDV MYA98, single B antigen epitope on VP1 141—160 aa(B) and the combination of B antigen epitope and T antigen epitope 141—160 aa-21—40 aa-141—160 aa(BTB) epitopes, were inserted into CAP vector protein from PCV2 to construct the recombined Bacmids reBAC-CAP-B, reBAC-CAP-BTB. These recombined Bacmids were transfected into Sf9 cells to express fusion proteins CAP-B，CAP-BTB respectively. After amplifying the viral stock, the high-titer stock was infected to cells for protein expression. The results of SDS-PAGE, Western blot and TEM showed that the proteins with the right molecule size had the specific immunogenicity and were assembled into VLPs successfully.

Keywords：FMDV; PCV; VLPs; antigen epitope; baculovirus-insect cell expression system