猪混合感染牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒和大肠杆菌的诊断

王宇婷，常敬伟，李超，马莉莉，周玉龙，倪宏波

猪混合感染牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒和大肠杆菌的诊断

王宇婷，常敬伟，李超，马莉莉，周玉龙，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）不仅感染奶牛和黄牛，还会感染猪、鹿和羊等多种动物。猪感染BVDV会出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。本试验通过对黑龙江大庆市某猪场送检的病猪进行实验室诊断，确诊该病猪为牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和大肠杆菌混合感染。

牛病毒性腹泻病毒；猪瘟病毒；猪蓝耳病毒；大肠杆菌；混合感染

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒属，与猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和羊边界病病毒（border disease virus，BDV）同为瘟病毒属，三者病毒上血清学存在交叉反应[1]。CSFV和BVDV均可感染猪，猪感染CSFV会引起高热和败血症等致病性症状[2]。而猪感染BVDV表现出的症状与慢性猪瘟类似，CSFV与BVDV之间还存在交叉感染的情况。猪蓝耳病也称为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive an-drespiratory syndrome，PRRS），该病主要引起猪的繁殖障碍和呼吸道症状，PRRSV感染猪后会导致免疫抑制，造成潜在感染其他病原体，从而给猪场造成巨大的经济损失[3]。猪大肠杆菌（Escherichia coli，E.Coli）病在临床上主要表现为仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病等，该病具有较高的发病率和死亡率[4]。本文对黑龙江大庆市某猪场发病的保育猪，进行了实验室诊断，确诊为牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和大肠杆菌混合感染，诊断结果报告如下[5]。

1 发病情况

2016年5月，黑龙江省大庆市某猪场保育仔猪出现腹泻，生长迟缓，发病率高，死亡率10%～20%，用多种抗生素治疗效果不佳。猪群曾接种过细胞源猪瘟活疫苗，但未完全控制疫情。

2 临床症状

保育猪体温升高、精神沉郁、食欲减退，消瘦、腹泻，生长缓慢，腹部膨胀，双耳发蓝发绀，体表有针尖状出血点，尤其是腹部皮肤和四肢。

3 剖检变化

经剖检病猪，可见喉头有出血点；颌下淋巴结肿大，周边有出血点，切面呈大理石样；弥漫性间质性肺炎；脾边缘出血性梗死；胃黏膜出血；肠道卡他性炎症，肠系膜淋巴结充血肿大。

4 细菌分离鉴定与药敏试验

无菌采取猪的肝脏、脾脏和肺脏和肠内容物按常规方法分别接种于5%兔血营养琼脂培养基和麦康凯培养基进行细菌分离鉴定。次日，5%兔血营养琼脂培养基未发现细菌生长，但在麦康凯培养基上长出桃红色、圆形和边缘整齐的菌落，通过镜检和生化试验确定为大肠杆菌[6]。将分离到的大肠杆菌进行致病性试验，小白鼠24 h内死亡，说明其具有较强致病性。药敏试验结果显示，盐酸头孢喹肟和多黏菌素B对大肠杆菌敏感。

5 PCR检测

5.1 引物设计和合成CSFV和PRRSV特异性检测引物由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，BVDV特异性检测引物参照参考文献[7]，引物序列如表1所示，引物由上海生物工程技术有限责任公司合成。

表1 引物序列Table1 Primer squence

5.2 样品的处理与病毒基因组的提取将无菌采集的脾、肺和下颌淋巴结等病料混合加入4 mL的DEPC水，充分研磨均匀，吸取研磨好的液体，加入到无RNA酶的EP管内。根据病毒基因组RNA试剂盒（购自北京博凌科为生物科技有限公司）使用说明的操作方法提取组织病料的病毒基因组RNA，并反转录为cDNA备用（购自赛默飞世尔科技中国有限公司）。

5.3 PCR PCR的扩增与检测以反转的病毒基因组cDNA为模板，进行CSFV、BVDV、PRRSV的PCR扩增。PCR反应体系为：Buffer 2.5μL、MgCl22μL、dNTP 2μL、上下游引物各1μL、模板1μL、加水至25μL。BVDV、CSFV、HPRRSV和PRRSV的PCR扩增程序为：94℃3 min 30 s预变性；94℃35 s变性；72℃40 s延伸，72℃6 min终延伸，30个循环，退火40 s，温度分别是56、57、55和51℃。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1和图2所示，CSFV扩增产物位于599 bp大小处均可见特异性条带，与目的基因相符；HPRRSV和PRRSV PCR扩增产物位于420 bp和 372 bp大小处均可见特异性条带，与目的基因相符；BVDV PCR扩增产物位于288 bp大小处均可见特异性条带，与目的基因相符。

图1 CSFV和PRRS PCR扩增结果Fig.1 The result of CSFV and PRRS PCR

图2 BVDV PCR扩增结果Fig.2 The result of BVDV PCR

5.4 核酸序列鉴定将临床组织病料的BVDV阳性扩增产物胶回收（试剂盒购自上海百赛生物技术有限公司）与pMD-18T连接后，选取阳性菌送往哈尔滨博仕生物技术有限公司进行序列测定，将测序结果应用Blast在线软件GenBank中登录的序列进行比较分析表明，BVDV阳性PCR扩增产物彼此间序列完全一致，其与GenBank中登录的BVDV毒株序列（KF006975.1）同源性达97%。

6 诊断结论

经猪场发病情况、临床症状和病理剖检变化等临床诊断，以及细菌分离培养、PCR检测、核酸序列鉴定等实验室诊断方法确定，该猪场混合感染牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和大肠杆菌。

7 讨论

猪感染BVDV主要途径为猪免疫接种BVDV污染猪用疫苗及接触到BVDV感染牛羊和BVDV污染的饲料两种途径。猪接触感染BVDV的牛和羊，采食污染BVDV的饲料，饲喂BVDV污染的牛奶或牛羊内脏以及用污染BVDV的饲养工具等都可引起猪感染BVDV。报道显示，可在接触到接种BVDV疫苗牛的猪体内检测到BVDV抗体[8]。

本病例中的临床组织样品检测结果为牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病毒和大肠杆菌混合感染。该猪场免疫接种过猪瘟疫苗，但未能完全控制疫情。其原因可能为BVDV的感染可对猪瘟活疫苗的免疫产生干扰作用，其在抑制猪瘟抗体产生的同时，也刺激机体产生BVDV的抗体，从而导致猪瘟免疫失败。BVDV在一定程度上干扰猪瘟活疫苗的免疫效果，影响CSFV抗体水平。牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒和猪蓝耳病毒均具有免疫抑制特性，导致机体免疫力下降，容易混合感染大肠杆菌，并且前期报道过大肠杆菌对常用抗菌药物耐药的发展越来越令人担忧[9]。

一般认为猪感染BVDV主要原因是猪使用了被BVDV污染的生物制品，尤其是猪瘟疫苗，这给猪瘟的预防控制及净化带来了新的困难与挑战。因此，预防控制BVDV在猪群的感染，要加强生物试剂的生产和安全管理，从源头上遏制BVDV污染的可能性，加强对猪群中BVDV的监测，及时淘汰阳性感染猪，这些应引起广大兽医工作者重视。

[1]陶洁，廖金虎，张倩，等.猪感染牛病毒性腹泻病毒研究进展[J].中国预防兽医学报，2014，36（5）：410-413.

[2]邱美珍，杨俊，杜丽飞，等.猪群中牛病毒性腹泻病毒所致的类似猪瘟及检测方法[J].湖南畜牧兽医，2015，（2）：4-6.

[3]文丽，赵兵军.猪蓝耳病的研究进展与防控策略[J].浙江畜牧兽医，2013，38（3）：15-16.

[4]刘峰，张进，刘毅.猪大肠杆菌病防治研究进展[J].湖南畜牧兽医，2010（6）：1-3.

[5]吴建军.猪感染牛病毒性腹泻的诊断[J].畜牧与兽医，2014，46（11）：109-110.

[6]廖延雄.兽医微生物实验诊断手册[M].北京：中国农业出版社，1995.

[7]王树成，林建辉，刘宏，等.用MDBK传代细胞繁殖BVDV毒株的研究[J].中国动物检疫，1995，12（4）：6-8.

[8]Stewart WC,Carbrey EA,Jenney E W,et al.Bovine viral diarrhea infection in pigs[J].J Am Vet Med Ass,1971,159(11):1556-1563.

[9]教郁，高维凡，胡彩光.大肠杆菌耐药性研究进展[J].现代畜牧兽医，2013，5：54-57.

Diagnosis ofthe combined infection bovine viraldiarrhea virus,
classicalswine fever virus,Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and E.coilin pigs

Wang Yuting,Chang Jingwei,Li Chao,Ma Lili,Zhou Yulong,Ni Hongbo*
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319）

Bovine viral diarrhea virus(BVDV)not only infected cows and cattle,but also infected pigs,sheep,deer and other animals.Pigs infected with BVDV occurs clinical symptoms and pathological changes similar to classical swine fever.In this study of a farm in Daqing City in Heilongjiang infected of pigs for laboratory diagnosis,confirmed that pigs as bovine viral diarrhea virus,classical swine fever virus,porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus and Escherichia coli combined infection.

Bovine viral diarrhea virus;Classical swine fever virus;Porcine reproductive an-drespiratory syndrome virus;Escherichia coli;Combined infection

S858.23

B

1672-9692(2016)11-0033-04

2016-09-11

王宇婷（1992-），女，在读硕士研究生，研究方向：兽医微生物与免疫学。

倪宏波（1972-），男，教授，主要从事兽医微生物与免疫学。