霍山石斛的组织培养研究

敖静陈文张云霞

（1.深圳市双晖农业科技有限公司 深圳 518000 2.深圳市华盛实业股份有限公司 深圳 518000）

霍山石斛的组织培养研究

敖静1陈文2张云霞1

（1.深圳市双晖农业科技有限公司 深圳 518000 2.深圳市华盛实业股份有限公司 深圳 518000）

以霍山石斛种子为外植体，不同激素为变量，筛选出霍山石斛种子萌发、增殖培养、生根壮苗培养各阶段适宜的培养基配方。结果表明，霍山石斛种子萌发适宜的培养基配方为花宝一号1.5g·L-1+花宝二号0.5g·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.3mg·L-1+ 香蕉 100g·L-1+ 蔗糖 30g·L-1+ 琼脂 4.75g·L-1+ 碳粉 0.5g·L-1+ 肌醇 100g·L-1+ 牛肉蛋白胨 1g·L-1，种子萌发状态好，颜色翠绿。继代增殖适宜的培养基配方为MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+琼脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L，霍山石斛增殖倍数达到2.5，增殖苗生长势较好，6-BA对霍山石斛增殖实验增殖的影响显著，NAA、KT对霍山石斛增殖的影响不显著。适宜的生根壮苗培养培养基配方为MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+琼脂4.8g/L+6-BA1.5mg/L+NAA0.5-1mg/L+IBA1-1.5mg/L。霍山石斛试管苗长势较好，茎粗壮，平均生根数达到9根以上。6-BA对霍山石斛生根壮苗培养株高影响极显著，IBA对霍山石斛生根壮苗培养株高影响显著，6-BA对霍山石斛生根培养茎粗效果极显著。

霍山石斛；种子萌发；增殖培养；生根壮苗

1 前言

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng）又名米斛、龙头凤尾草，兰科石斛属多年生草本植物。性喜阴凉湿润、通风多雾的环境[1]。是中国兰科石斛属药用植物中最为珍稀名贵的品种，据本草纲目记载，霍山石斛具有“强阴益精、厚肠胃、补内绝不足，轻身延年”等功效。现代医学研究表明，霍山石斛含有丰富的石斛碱，多糖等多种活性物质，抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力效果显著[2]。享有“软黄金”、“千金草”、“中华仙草之最”等美誉[3]。由于霍山石斛种子极难萌发，萌发后生长极为缓慢以及所需自然环境苛刻和过度采伐等原因，野生资源已濒临灭绝[4]。针对此类自身繁殖率低的植物，植物组织培养技术是解决霍山石斛快速扩繁难题的重要途径。本研究以霍山石斛种子为外植体，进行了组培技术的研究，筛选出霍山石斛组织培养各阶段的最佳组培配方，建立了种苗快速扩繁技术体系，为霍山石斛的规模化种植优质种苗的获取提供参考。

2 材料与方法

2.1 种子萌发培养基的筛选

设置四种不同的种子萌发培养基配方，具体配方如：①MS；②花宝一号1.5g/L；③花宝二号0.5g/L；④花宝一号1.5g/L+花宝二号 0.5g/L。添加肌醇 100mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.3mg/L。采摘成熟未开裂无病斑的饱满霍山石斛蒴果，流水冲洗1h。超净工作台上，先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％的Hg－Cl2溶液消毒20min，无菌水冲洗4～5次，无菌滤纸吸干蒴果表面水分。在石斛蒴果两端横切一刀，用镊子沿霍山石斛蒴果纵向生长方向夹住蒴果，轻轻将霍山石斛种子撒入种子萌发培养基中，每个处理接种20瓶。培养40d后拍照统计种子萌发情况，生长势，颜色。

2.2 继代增殖培养基的筛选

以MS为基本培养基，选用L16（43）正交表，共16个处理（表1），6-BA、KT 设置 4 个水平，分别为 0mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1、1.5mg·L-1。NAA 设置 4 个水平分别为 0mg·L-1、0.2mg·L-1、0.5mg·L-1、1mg·L-1。外植体选择高度1cm左右的霍山石斛无菌苗。每个处理接种20瓶，每瓶接种5棵小苗。培养60d后拍照统计增殖倍数，生长势。

表1 霍山石斛增殖培养正交实验方案L16（43）

2.3 生根壮苗培养基的筛选

以MS培养基为基本培养基，选取选用L16（43）正交表，共16个处理（表 2），6-BA 设置 4 个水平，分别为 0mg·L-1，0.2mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，NAA 和 IBA 设置 4 个水平，分别为 0mg·L-1，0.5mg·L-1，1mg·L-1，1.5mg·L-1。外植体选择高度达到 1.5cm 的霍山石斛无菌苗，每个处理接种20瓶，每瓶接种5棵小苗。培养90d后拍照统计生根数，株高，茎粗。

2.4 培养条件

表2 霍山石斛生根壮苗正交设计实验方案L16（43）

试验中所使用的培养基均添加香蕉100g·L-1、蔗糖30g·L-1、碳粉 0.5g·L-1、牛肉蛋白胨 1g·L-1、琼脂 4.8g·L-1，pH 为 5.8，温度（25±2）℃，光照强度 2000Lx，光照时间 10h·d-1条件下培养。

3 结果分析

3.1 种子萌发培养基筛选

播种10d后，各个培养基种子开始萌动膨大，刚开始为淡黄色，后期逐渐转绿。处理1种子萌发状态良好，原球茎饱满，生长势较好，颜色嫩绿，健壮。处理2种子基本萌发，原球茎较饱满，生长势一般，颜色黄绿。处理3种子基本萌发，原球茎细小，生长势一般，颜色黄绿。处理4种子萌发状态良好，原球茎饱满，生长势最好，颜色浓绿。处理1和处理4种子萌发情况普遍高于其他组培养基，培养40d后颜色翠绿，部分还长出一片嫩叶，其中处理4种子萌发生长势较优，MS培养基培养次之，单独加花宝一号或二号其种子萌发状态不好，原球茎不够饱满，颜色黄绿。综合分析可得适宜霍山石斛种子萌发的培养基配方为：花宝一号1.5g/L+花宝二号0.5g/L培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L。培养40d后培养基上充斥了石斛种子，部分种子挤压在一起而吸收不到营养物质及光照而变黄发白死亡，40d后需转接一次。

3.2 增殖培养基筛选

继代增殖培养是植物离体快繁的第二个重要阶段，通过增殖培养，促进分蘖数的增大，提高扩繁率。通过将苗高1cm左右的无菌苗接种于各增殖培养基中，60d后统计增殖倍数、生长势。

表3 霍山石斛增殖试验极值分析表

从增殖实验极值分析表（表3）中可以看出，3个因素对其增殖倍数和生长势的主次关系为：6-BA对霍山石斛增殖的影响力最大，其次是NAA，最后是KT。较优组合是A4B1C4。继续进行方差分析，由表4方差分析可知，6-BA对霍山石斛增殖实验增殖的影响显著，NAA、KT对或霍山石斛增殖实验增殖的影响不显著。三种激素对株高效果的影响均不显著。

表4 霍山石斛增殖试验方差分析表

不同培养基激素配方，其芽增殖情况各不相同，高浓度的6-BA配合较高浓度的KT及较低浓度的NAA，更容易促进霍山石斛芽增殖。在较高浓度的6-BA下，随着KT浓度的升高和NAA浓度的降低，其增殖倍数逐渐上升，生长势均保持在较高水平。增殖倍数最高的是处理13，其平均增殖倍数达到3，其次是处理14，其平均增殖倍数为2.9。处理3和14其6-BA浓度均为1.5mg/L，处理13无添加NAA，KT浓度较高为1.5mg/L，平均增殖倍数最高。而处理14添加了0.2mg/LNAA配合1mg/LKT，增殖倍数稍低为2.9，但也处于较高水平。增殖实验中各个处理生长势均较好，平均生长势得分达到3.6以上。其中处理13和14平均生长势最好为4.2，因此较高浓度的6-BA配合较高浓度的NAA和较低浓度的KT更有利于霍山石斛增殖苗的生长，其霍山石斛增殖苗长势较好，颜色翠绿，健壮。若不添加6-BA，不管NAA浓度和KT浓度怎么变化，霍山石斛增殖苗生长势均较差。综合以上分析，霍山石斛丛生芽增殖处理以处理13最佳，最佳激素配方为MS+6-BA1.5mg/L+KT1.5mg/L。

3.3 生根壮苗培养基筛选

表5 霍山石斛生根壮苗试验极值分析表

生根壮苗试验是组培苗生产的最后一个环节，通过此步骤，促进霍山石斛组培苗生根及枝条的粗壮。将高1.5cm左右的无菌苗接种于各生根培养基中，90d后统计株高、根数、茎粗情况。结果表明：较高浓度的生长素能促进霍山石斛生根。当6-BA浓度为0.5mg/L，NAA浓度为0.5mg/L，IBA浓度为1.5mg/L时，霍山石斛平均生根数最高，达到22.1根，当6-BA浓度为1mg/L，NAA浓度为1.5mg/L时，平均生根数较低是13根。从株高和茎粗来看，当6-BA浓度为0.5mg/L时，IBA浓度在0～1mg/L，NAA浓度在1～1.5mg/L时，霍山石斛生根壮苗试验中株高最高达到3.6cm，茎粗达到3.4～3.5mm。但若6-BA浓度在0.5mg/L时，IBA浓度为1.5mg/L，NAA浓度为0.5mg/L时，其株高和茎粗反而更低为3.3cm和3.3mm。而当6-BA浓度为1mg/L时反而不利于霍山石斛株高和茎粗的增高。因此较高浓度的6-BA均不利于霍山石斛株高和茎粗的增高。通过表3极值分析可以看出，6-BA、NAA、KT对霍山石斛生根壮苗影响的主次关系为：株高6-BA＞IBA＞NAA，根数、茎粗6-BA＞NAA＞IBA。各个指标下的较优组合为A3B2-3C3-4，各个激素适宜的浓度为6-BA为0.5mg/L，NAA 0.5～1mg/L，IBA 1～1.5mg/L。由表6方差分析可知，6-BA对霍山石斛株高影响极显著，IBA对霍山石斛株高影响显著，NAA对霍山石斛株高影响不显著。6-BA、NAA、IBA对霍山石斛生根效果不显著。6-BA对霍山石斛茎粗效果极显著，NAA、IBA对茎粗影响不显著（见表6）。

综合以上分析，霍山石斛生根壮苗的最佳激素配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L。培养时间是90d。当霍山石斛株高达到3cm以上，叶片3片以上，茎粗达到2mm以上，根数达到3根以上即可炼苗后移植室外。

4 讨论

以种子为外植体进行无菌播种产生种苗或者形成原球茎并增殖，进而分化发育成完整植株是石斛类组培扩繁的重要途径，霍山石斛种子萌发对培养基要求不高，MS、花宝均适宜作为霍山石斛种子萌发培养基。本研究结果表明，以霍山石斛种子在花宝一号1.5g/L+花宝二号0.5g/L培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L上萌发效果最好。钱文林[5]发现霍山石斛在花宝1号1.0mg/L+花宝2号1.0g/L能进行种子萌发。花宝1号+花宝2号同样适宜霍山石斛种子萌发诱导，配合低浓度的细胞分裂素和生长素更有利于促进霍山石斛种子萌发。这与胡万群[6]发现适宜的霍山石斛在1/2MS配合低浓度的BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+10％马铃薯汁培养基上能促进未成熟种胚萌发相符。霍山石斛增殖培养过程中，不同的培养基配方其增殖效果各不相同。本研究结果表明，MS+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L上培养增殖倍数能达到2.5，高浓度的细胞分裂素能促进霍山石斛增殖，傅玉兰[7]等研究发现以MS为基本培养基，添加激素KT3mg/L+2，4-D0.2mg/L，增殖效果最好，KT浓度越高，增殖倍数越高。霍山石斛生根壮苗培养过程中，生长素对生根壮苗影响较大，周则刚[8]等研究发现霍山石斛芽生根的最佳培养基为1/2MS+0.5mg/L IBA。而胡万群[9]发现霍山石斛在1/2MS+NAA 0.5mg/L中生根效果好，能得到大量整齐一致的霍山石斛种苗。唐英武[9]研究发现，霍山石斛生根的最适培养基为MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L。而本研究发现霍山石斛生根壮苗的最佳激素配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5～1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培养出的试管苗从根数、株高、茎粗均达到较高水平。说明高浓度的IBA配合低浓度的NAA更有利于霍山石斛生根。这与刘建美[10]的研究一致。因此细胞分裂素和生长素配合更有利于霍山石斛生根壮苗培养。

5 结论

霍山石斛种子萌发最佳培养基为花宝一号1.5g/L+花宝二号0.5g/L培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+琼脂4.75g/L+碳粉0.5g/L+肌醇100mg/L+牛肉蛋白胨1g/L，40d需转接一次。继代增殖中，MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+琼脂 4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+KT 1.5mg/L为最佳的增殖培养基配方，增殖倍数能达到2.5，培养时间是60d。生根壮苗培养过程中，适宜的生根壮苗培养基配方为MS+香蕉100g/L+蔗糖30g/L+碳粉0.5g/L+牛肉蛋白胨1g/L+琼脂4.8g/L+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5-1mg/L+IBA 1～1.5mg/L，培养时间是90d。通过本试验筛选出了霍山石斛播种-增殖-生根培养各阶段适宜的培养基配方，建立了该途径的种苗快速繁殖体系，对促进霍山石斛种苗工厂化生产和规模化种植优质种苗的获取有重要作用。

目前，霍山石斛组培技术研究已有一定进展，但也存在一些问题，主要有：①未从工厂化生产角度研究既能降低成本，又能培养优质试管苗的培养技术，且工厂化培养技术规程尚未有人研究。②种子萌发途径培育出的试管苗性状参差不齐。③组培生产和大田移栽衔接较少。针对以上问题，今后的研究可从下方面进行研究：①从节约成本角度改良培育技术，加强光照、温度、湿度、切割手法等的研究，缩短培养周期，提高生产效率，形成工厂化生产的技术规程。②提高自身育种技术，培育优质的种子资源并加强种质资源的保存。③探索以茎段、叶片、腋芽等为外植体进行组培扩繁技术。④加强大田移植技术的研究，建立大田种植技术规程[11]。

表6 霍山石斛生根壮苗试验方差分析表

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S567.2

：A

：1005-7897（2016）22-0001-04

2016-11-12

敖静（1989-），女，中级农艺师，硕士，主要从事作物遗传育种工作。

深圳市技术攻关项目（JSGG20141118110444062）。