笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

杨　洋，　崔百会，　刘　喆，　曹后男，　宗成文

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)



笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

杨洋，崔百会，刘喆，曹后男，宗成文*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

摘要：以笃斯越橘花朵为试材，根据兔眼蓝莓查尔酮合成酶(VaCHS)mRNA全长序列设计1对特异性引物，RT-PCR扩增出长度大约为1 400 bp目的片段，经测序,结果表明，笃斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全长1 391 bp，包含1 170 bp开放阅读框(ORF)，编码389个氨基酸，将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列进行比对，发现与兔眼蓝莓、杜鹃花和猕猴桃的一致性分别为99%、93%和93%，该基因蛋白质的氨基酸序列与其他植物CHS基因蛋白质的氨基酸序列进化分析表明，与兔眼蓝莓和猕猴桃属于同一分支，与兔眼蓝莓亲缘关系最近。

关键词：笃斯越橘；CHS基因；克隆；序列分析

笃斯越橘(Vacciniumuliginosum)，为杜鹃花科越橘属植物，落叶灌木[1]，其果皮含有丰富的花青素，具有抗氧化性[2]，对眼科和心血管疾病具有很好的疗效[3-4]。花青素又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在，也称花色苷，是植物花和果实呈现艳丽颜色的主要物质基础[5]。花青素存在于许多新鲜果实中，是一种促进健康的重要植物化学物质[6]，是由苯丙氨酸先转化为4-香豆酰CoA，然后在CHS(查尔酮合成酶)、CHI(查尔酮异构酶)、FHT(黄烷酮-3β-羟基化酶)、F3’H(类黄酮3′-羟化酶)、F3’5’H(类黄酮3′5′-羟化酶)、DFR(黄烷酮醇4-还原酶)、ANS(花青素合成酶)等多种酶的作用下形成，再在MYB、WD40、bHLH等转录因子的作用下使得花青素在UFGT(UDP葡萄糖-类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)结构基因的调控下与糖结合形成相对稳定的花青苷[7]，再进一步形成自然界中所看到的各种颜色。

查尔酮合成酶(CHS)是花色苷合成途径中，第1个关键的酶基因，有报道指出[8-9]，分别导入正义CHS基因和反义CHS基因在开粉红色的菊花中，结果获得了开浅红色和白色花的转基因植株，相同的技术在牵牛、天竺葵和玫瑰中也取得了成功[10-12]。杨会娜等[13]人研究表明，在棕色棉中，CHS基因的表达量明显高于白色棉。Li等[14]和宋杨等[15]人研究中发现，蓝莓和越橘花青苷合成过程中CHS基因相对表达量的变化趋势与果实中花青苷含量的变化相一致。说明CHS基因在植物花色、果实着色等方面起着非常重要的作用。

在越橘属的其它种中，如欧洲越橘[16]、高丛越橘[7]和蓝莓[14]等，有关花青苷合成相关的研究均有报道，但有关笃斯越橘花青苷途径中全长基因克隆的研究却未见报道。所以本研究以笃斯越橘盛花期花朵为试材，克隆其CHS基因，并进行序列分析，为以后探索笃斯越橘果皮着色机理的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

取自延边大学温室大棚中栽植的笃斯越橘盛花期花朵。

1.2试剂

植物RNA快速提取试剂盒、凝胶回收试剂盒(购自北京华越洋公司)，反转录试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、普通Taq酶、ExTaq酶、dNTPs、Mix Buffer和大肠杆菌DH5a等[均购自Takara(大连)工程有限公司]，引物由invitrogen(上海)公司合成。

1.3RNA的提取与cDNA全长的克隆

根据植物RNA快速提取试剂盒的说明，提取笃斯越橘花朵的总RNA；将提取的RNA按照反转录试剂盒的说明进行反转录，合成cDNA第1条链，利用在GeneBank中登录的兔眼蓝莓CHS基因(VaCHS)的mRNA序列全长(登录号：AB694903)，用Primer Premier 5.0软件设计并合成笃斯越橘CHS基因(VaCHS)的特异引物:

VaCHSF：

5’-CACACATTCTCACTTAACCCTCC -3’

VaCHSR：

5’-ACAATAGGCTTTATCAGCCCTT -3’

PCR扩增程序为：95 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，根据胶回收试剂盒的说明切胶回收目的条带，最后根据pMD18-T载体试剂盒的说明将目的基因与载体连接，转化大肠杆菌DH5a后，经蓝白斑筛选挑选阳性克隆，并进行PCR菌液检测，筛选与目的条带大小相一致的菌液送invitrogen(上海)公司测序，获得其cDNA的全长。

1.4序列分析与系统发育树的构建

用 ClustalX 1.81[17]及其默认参数生成多重序列比对，GeneDoc 生成比对结果。用MEGA5.1(Phylogenetic and molecular evolutionary analyses version 5.1)[18]构建邻接树(neighbour joining tree，NJ tree)，均用1 000个重复进行Bootstrap检验，采用默认的 Poisson correction 模型和 complete deletion 选项。

2结果与分析

2.1RNA提取与RT-PCR扩增

提取的笃斯越橘总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1A)，结果表明，提取的RNA无其它杂质残留，质量可用于后续试验。以其花朵的cDNA为模板进行目的片段PCR扩增(图1B)，获得了大约1 400 bp的片段，与预计的片段大小相一致。

M:DL2000Marker；A：提取的总RNA；B：VuCHS基因RT-PCR扩增结果

2.2序列分析

测序结果表明，克隆得到的VaCHS基因的cDNA全长为1 391 bp，包含1 170 bp开放阅读框(ORF)，编码389个氨基酸(图2)，利用DNAMAN分析软件对预测的VaCHS蛋白质特征进行分析，发现其分子质量为42 527.24 Da，等电点pI为5.91。

图2　VuCHS基因碱基序列及所编码的氨基酸序列

经BLAST蛋白质序列比对，发现笃斯越橘CHS基因(VuCHS)，与GeneBank中报道的兔眼蓝莓和杜鹃花CHS基因蛋白质序列的同源性分别达到99%和93%，与其它科属如猕猴桃、元宝草、陆地棉、山茶花等一致性分别为93%、93%、92%和93%，说明所克隆的VuCHS基因是查尔酮合成酶基因,并用GeneDoc软件将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与已知其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列用ClustalX 1.81软件进行对比(图3)，在氨基酸的第32处，笃斯越橘的氨基酸翻译为天冬氨酸(D,Asp)，与其他植物相同，而兔眼蓝莓在该处翻译的氨基酸是谷氨酸(E,Glu)，在氨基酸的第351处，笃斯越橘氨基酸翻译为蛋氨酸(M,Met)，而其他植物该处氨基酸翻译为赖氨酸(K,Lys)。

“▲”为与其他植物不同的氨基酸

利用MEGA5.1软件生成系统发育树(图4)，由图可知，笃斯越橘与兔眼蓝莓和猕猴桃、重瓣映山红、山茶、野茶树属于同一个分支，与兔眼蓝莓的亲缘关系最近[19]。

GhCHS陆地棉(ABS52573);AeCHS秋葵(AGW22222);GrCHS1雷蒙德氏棉(XP_012481763);GaCHS1木本棉(KHG25969);NnCHS荷花(ADD74168);EgCHS1巨桉(XP_010023738);MmCHS多花野牡丹(AGW24283);HsCHS元宝草(AFU52909);HpCHS金丝桃(AAL67805);VuCHS笃斯越橘;VaCHS兔眼蓝莓(BAO58434);AcCHS猕猴桃(AGV53049);RsCHS杜鹃花(CAC88858);CjCHS山茶花(BAI66465);CsCHS野茶树(AAO13091);VvCHS葡萄(BAB84111);JcCHS1麻风树(NP_001295723);PpeCHS碧桃(AEJ88217);PaCHS甜樱桃(AJO67963);PceCHS樱桃李(AKV89241);FaCHS草莓(BAE17124);RrCHS玫瑰(AKT71852);PbCHS-like白梨(XP_009370115);MtCHS变叶海棠(ADV29810);SaCHS欧洲花楸(ABB89213);MdCHS苹果(BAB92996);PpyCHS沙梨(AFQ92052);PcoCHS西洋梨(AAX16494)。

3讨论与结论

本研究所克隆的笃斯越橘CHS基因cDNA全长为1 391 bp，包含1 170 bp开放阅读框(ORF)，编码由389个氨基酸组成的蛋白，经BLAST蛋白质比对与其他植物的一致性高达89%～99%,可以初步断定所克隆的VuCHS是CHS基因。查尔酮合成酶的主要功能是催化1分子的香豆酰CoA与3分子的丙二酰CoA缩合反应形成查尔酮[20]，是类黄酮途径中第1个关键酶，经NCBI中ProteinsBLAST比对分析得知[21]，其保守区极具保守性；本研究所克隆的VuCHS基因是属于CHS超基因家族，具有该蛋白活性位点、产物结合位点和丙二酰CoA结合位点(图5)，进一步证实了本试验所克隆的VuCHS基因为CHS基因。

图5　笃斯越橘CHS基因编码蛋白功能构域分析

前人的研究表明，CHS基因不仅与植物的花色有关[10-12]，还与植物的育性有关。邵莉等人[22]，将CHS-A基因导入到矮牵牛中，不仅改变了花的颜色还出现了雄性不育现象，其实早在玉米中就有这类现象，CHS基因的突变导致出现了白色不育的花粉粒[12,22]。CHS基因是花青苷途径中一个重要的酶基因，与果实的色泽也有重要的联系，所以对笃斯越橘CHS基因的克隆，为以后该植物花色、育性、果皮色泽等研究提供理论基础。

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收稿日期：2016-04-13基金资助:国家自然科学基金项目(31460504)；吉林省科技支撑计划重点项目(20120251)

作者简介：杨洋(1991—)，女，吉林敦化人，在读硕士，研究方向为果树生物技术。宗成文为通信作者， E-mail:zongchengwen@aliyun.com

文章编号：1004-7999(2016)02-0093-06

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.02.001

中图分类号：S663.9

文献标识码：A

Cloning and sequence analysis of Chalcone Synthase gene in anthocyanin biosynthesis pathway of Vaccinium uliginosum

YANG Yang，CUI Baihui，LIU Zhe，CAO Hounan，ZONG Chengwen*

(AgriculturecollageofYanBianUniversity,YanjiJilin133002，China)

Abstract：Using one pair of specific primers designed based on the mRNA full-length sequence of Chalcone synthase in Vaccinium ashei accessioning on GeneBank, a target DNA fragment about 1 400 bp long was amplified from the total RNA of Vaccinium uliginosum by RT-PCR. Sequencing result showed that full length of the cDNA sequence of Chalcone synthase gene from Vaccinium uliginosum was 1 391 bp with 1 170 bp open reading frame encoding a protein comprise of 389 amino acids. The identities of amino acid sequences of the protein encoded by CHS genes from Vaccinium uliginosum with Vaccinium ashei, Rhododendron simsiiand and Actinidia chinensis were 99%, 93% and 93%, respectively. The phylogenic tree of amino acid sequences of the proteins encoded by CHS genes from Vaccinium uliginosum and other species revealed that Vaccinium uliginosum, Vaccinium ashei and Actinidia chinensis belonged to the same branch, and Vaccinium uliginosum was the most closely related to Vaccinium ashei.

Key words:Vaccinium uliginosum; Chalcone Synthase; cloning; sequence analysis