利用改良电融合法制备杂交瘤细胞的试验探索

吴　　梦，刘作华，3，罗　　林，丁玉春，葛良鹏*，3（.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.农业部养猪科学重点实验室，重庆 荣昌 402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 荣昌 402460）

利用改良电融合法制备杂交瘤细胞的试验探索

吴梦1，2，刘作华1，2，3，罗林1，丁玉春1，2，葛良鹏*1，2，3
（1.重庆市畜牧科学院，重庆 荣昌 402460；2.农业部养猪科学重点实验室，重庆 荣昌 402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 荣昌 402460）

摘要：目的：运用改良电融合法提高杂交瘤的融合效率，以获得更多的杂交瘤克隆。方法：将SP2/0细胞和脾细胞分别用NHS_d_PEG24_biotin孵育30min，再将脾细胞用avidin孵育30min，然后将SP2/0细胞和脾细胞按1：5混合孵育15min后进行电融合，融合后的细胞用半固体培养基筛选单克隆。结果显示：用2×105个SP2/0细胞和1×106个脾细胞进行正常电融合，经半固体培养基筛选共获得6个单克隆，而用改良电融合法获得了20个单克隆。结论：利用改良电融合法能够增加异种细胞相互配对的几率，从而提高杂交瘤的融合效率，最终获得更多的杂交瘤细胞。

关键词：电融合；半固体培养基；杂交瘤

细胞融合产生杂交瘤细胞在生物技术和生物医药中扮演着重要的角色，并且已经广泛用于各个领域，其中最成功的就是利用杂交瘤生产单克隆抗体。近年来，融合技术的最新应用是将树突状细胞（DCs）与肿瘤细胞融合用于癌症的免疫治疗［1_2］。目前细胞融合主要有三种方法：病毒诱导细胞融合、聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合和电脉冲诱导细胞融合。虽然病毒诱导的细胞融合通常能够得到较高的融合率，但由于病毒不稳定，容易污染杂交瘤细胞，因而在治疗应用中受到了很大限制。PEG诱导细胞融合由于操作过程简单而被广泛应用，但该方法通常生产杂交瘤细胞较少，甚至还有化学结合。近年来，细胞电融合也被广泛使用，主要原因是电融合法克服了以上两种方法的缺点，采用物理方法的电融合，避免了病毒和化学试剂的污染，但电融合法生产杂交瘤的效率仍然较低，其原因在于两种细胞在融合前的排序是随机结合，尤其是当两种细胞大小有较大差异时，排序电压更容易让大细胞与大细胞接触，而需要融合的两种细胞接触机会减少，导致融合效率降低［3_5］。因此，本试验利用生物素_链霉亲和素能特异性、高亲和性结合的原理，将SP2/0细胞和脾细胞分别包裹NHS_dPEG24_biotin（biotin），再将脾细胞包裹avidin，然后将SP2/0细胞和脾细胞按比例混合孵育，使两种细胞相互配对，增加接触机会，经电融合后用半固体培养基筛选克隆。希望通过改良后的电融合法能够增加两种细胞配对的几率，提高融合效率，最终获得更多的杂交瘤克隆。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂SP2/0细胞由重庆市畜牧科学院畜牧工程研究所提供，OVA（A7641，Sigma）、CpG（tlrl_1826，InvivoGen）、FBS（10091_148，Gibco）、RPMI1640基础培养基（A10491_01，Gibco）、50×HT Media Supplement （H0137，Sigma）、Anti_Mouse IgG_Peroxidase antibody produced in goat（A4416，Sigma）、半固体培养基（03804，Stemcell）、NHS_dPEG24_biotin（10774，Quanta Bio Design）、Avidin（H0137，Sigma），常规试剂如无注明均购自Sigma公司。

1.1.2仪器多功能电融合仪（4308，Eppendorf），倒置显微镜（Eclipse_Ti，Nikon），CO2培养箱（371，Thermo），微孔板分光光度计（Epoch，BioTek），低速医用离心机（400C，北京白洋）。

1.1.3试验动物试验用6～8周龄BALB/c小鼠由重庆市畜牧科学院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1溶液配制等渗融合液：280mM葡萄糖、0.1mM （CH3COO）2Ca·H2O、0.5mM（CH3COO）2Mg·4H2O、0.1% BSA；低渗融合液：90mM葡萄糖、0.1mM（CH3COO）2Ca· H2O、0.5mM（CH3COO）2Mg·4H2O、0.1%BSA；RPMI1640完全培养基：10%FBS、1%青_链霉素、1%丙酮酸钠、1%L_谷氨酰胺、87%RPMI1640基础培养基。

1.2.2小鼠免疫及抗体效价检测按照常规免疫小鼠的方法［6］，对小鼠进行3次免疫，经ELISA检测效价合格后用于后续融合实验，具体免疫方案如下：首免用DPBS稀释OVA抗原，浓度为5 mg/mL；加入50μg CpG和等体积的2%氢氧化铝，混合均匀后再加入等体积的弗氏完全佐剂（CFA），涡旋使之乳化，按200μL/只剂量进行皮下分点注射；首免第14d后进行二免，OVA抗原浓度为2.5 mg/mL，加入25 μg CpG和等体积的2%氢氧化铝，混合均匀后再加入等体积的弗氏不完全佐剂（IFA），涡旋使之乳化，以200μL/只腹腔分点注射；二免第14d后进行三免，OVA抗原浓度为1.25mg/mL，加入12.5μg CpG和等体积的2%氢氧化铝，混合均匀后以200μL/只腹腔分点注射。第三次免疫3d后眼眶采血，分离血清用间接ELISA法检测血清效价，用OVA（10 μg/mL）包被，将抗血清进行10、100、1000倍稀释，用间接法检测抗体。可作为后续杂交瘤融合试验小鼠的判定标准为：稀释1000倍后的样品OD450/（阴性对照OD450_空白OD450）≥2。

1.2.3正常电融合法筛选杂交瘤使用颈椎脱臼法处死小鼠，用75%酒精浸泡5 min，取出脾脏分离脾脏淋巴细胞，并用血球计数板计数。取适量脾细胞与SP2/0细胞按1：5混合均匀，用10mL RPMI1640基础培养基洗涤细胞，1200r/min离心3min，弃上清；将等渗融合液与低渗融合液按1：1混合均匀，洗涤细胞2次，每次10mL，1200r/min离心3min，弃上清；将细胞用200μL融合液重悬，加入到融合槽内，设定融合参数，按下Start键，进行细胞融合，融合后放置30 min；将融合细胞用RPMI1640完全培养基洗涤2次，1200r/min离心3min，加入3mL RPMI培养基重悬细胞并加入6孔板中，37℃、5%CO2条件下培养过夜。将融合细胞以1200r/min离心5min，弃上清，用RPMI1640完全培养基重悬融合细胞，与半固体培养基按1：10混合均匀，加入6孔板中（2mL/孔），使培养基平铺于平板中，37℃、5%CO2条件下培养10～14 d；用10 μL枪头在显微镜下挑取单个克隆，加入到200μL含HT的RPMI1640完全培养基中，每隔一天换液培养。待克隆长到80%左右吸出150μL上清，然后用间接ELISA法检测抗体效价（参照1.2.2 ELISA检测步骤）。

1.2.4改良电融合法筛选杂交瘤取适量SP2/0细胞和脾细胞，分别加入10mL DPBS，混匀，加入NHS_ dPEG24_biotin（以下简称 biotin）50 μg，4℃孵育30min，1200r/min离心3min，弃上清；细胞用10mL DPBS洗涤2次，再用2mL DPBS重悬细胞，备用。加入200 μg avidin于脾细胞重悬液里，轻轻旋转离心管，混匀，4℃放置30min，1200r/min离心3min，弃上清；将SP2/0细胞与脾细胞按1：5轻轻混合均匀，室温放置30min，按照1.2.3的电融合步骤进行融合及筛选。

2　结果

2.1脾细胞和SP2/0细胞相互配对用SP2/0细胞孵育biotin，脾细胞先后孵育biotin和avidin，然后将SP2/0细胞与脾细胞按1：5混合孵育。从图1结果得知，脾细胞和SP2/0细胞配对情况良好，由于两种细胞大小差异较大，还会出现一个SP2/0细胞配对多个脾细胞的情况。

2.2正常电融合法与改良电融合法的融合效率比较通过半固体培养基的筛选培养，用正常电融合法制备的杂交瘤细胞共获得了6个克隆，经ELISA鉴定能够表达特异性抗体的克隆有2个；而用改良电融合法制备的杂交瘤细胞共获得了20个克隆，经ELISA鉴定能够表达特异性抗体的克隆有12个。因此，改良电融合法比正常电融合法的融合效率高，获得了更多表达特异性抗体的杂交瘤克隆。图2表示电融合法的融合过程。

图1　SP2/0细胞和脾细胞配对（200×）

图2　SP2/0细胞和脾细胞的电融合（200×）

3　讨论

生物素_亲合素系统（Biotin_Avidin_System，BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。本试验基于BAS系统的研究基础，在电融合前采用biotin、avidin分别包裹脾细胞和SP2/0细胞，然后对两种细胞进行相互配对。结果表明，脾细胞和SP2/0细胞经过biotin、avidin处理后，增加了两种细胞的接触机会，减少了相同细胞融合的几率。因此，用改良电融合法制备杂交瘤的数量明显高于正常电融合法，大大提高了融合效率。

虽然biotin、avidin的使用能够增加异种细胞的相互配对几率，提高融合效率，但从试验过程中得知，biotin、avidin对细胞仍然有一定毒性，造成细胞状态较差，最终导致融合效率提高不明显或者降低。因此，对于biotin、avidin的最佳使用浓度、结合时间等重要指标还有待进一步研究。总的来说，与正常电融合法相比，使用改良电融合法制备杂交瘤细胞能够明显提升融合效率，获得更多有效的杂交瘤克隆。■

参考文献：

［1］ Kanduser M，Usaj M.Cell electrofusion:past and future perspectives for antibody production and can_ cer cell vaccines［J］.Expert Opinion on Drug Deliv_ ery，2014，11（12）：1885_1898.

［2］Usaj M，Flisar K，Miklavcic D，et al.Electrofusion of B16_F1 and CHO cells：the comparison of the pulse first and contact firstprotocols［J］.Bioelectro_ chemistry，2013，89：34_41.

［3］TomitaM，Tsumoto K.Hybridoma technologies for antibodyproduction［J］.Immunotherapy，2011，3（3）：371_380.

［4］Yu X，Mcgraw P A，House F S，et al.An optimized electrofusion_based protocol for generating virus_spe_ cific human monoclonal antibodies［J］.Journal of Im_ munological Methods，2008，336（2）：142_151.

［5］Li J，Yu X，Wagner T E，et al.A biotin_streptavidin _biotin bridge dramatically enhances cell fusion［J］. Oncology Letters，2014，8（1）：198_202.

［6］ Lee E C，Liang Q，Ali H，et al.Complete hu_ manization of the mouse immunoglobulin loci enables efficient therapeutic antibodydiscovery［J］.Nature Biotechnology，2014，32（4）：356_363.

中图分类号：S818.9

文献标识码：B

文章编号：1001_8964（2016）07_0026_03

收稿日期：2016_04_26

基金项目：重庆市基本科研业务费项目 （2015cstc_jbky_00120，2014cstc_jbky_00111）；国家国际科技合作专项（2013DFA31820）；863项目（2014AA021602）；重庆市国际合作项目（CSTC2013gjhz80002）；重庆市基础与前沿研究重大项目（cstc2013jcyjC80001）；重庆市农发资金项目（12402）。

作者简介：吴梦（1987_），男，重庆人，硕士，主要从事抗体工程研究。

*通讯作者：葛良鹏，副研究员，E_mail:geliangpeng1982@163.com

The Study of Modified Electrofusion Method to Prepare Hybridoma Cell

WU Meng1，2，LIU Zuohua1，2，3，LUO Lin1，et al.
（1.Chongqing Academy of Animal Sciences，Chongqing Rongchang 402460；2.Key Laboratory of Pig Industry Sciences of Agriculture Ministry，Chongqing Rongchang 402460；3.Key Laboratory of Pig Industry Sciences of Chongqing City，Chongqing Rongchang 402460，China）

Abstract：By using the method of modified electrofusion to improve the hybridoma fusion efficiency and obtain more hybridoma clones.SP2/0 cells and spleen cells were incubated with NHS_d_PEG24_biotin for 30min，then spleen cells were incubated with avidin for 30min respectively，and the SP2/0 cells and spleen cells were incubatedby ration of 1：5 in 15 min，the fused cells used semi_solid medium for screening monoclonal.Using 2×105SP2/0 cells and 1×106spleen cells for normal electrofusion，the semi_solid medium screening obtained a total of 6 monoclonals，while modified electrofusion obtained 20 clones.The result showed that modified electrofusion could obviously increase the matching probability of heterogeneous cells，so as to improve the efficiency of hybridoma fusion and obtain more hybridoma cells.

Key words：Electrofusion；Semi_solid medium；Hybridoma