急性痛风性关节炎患者治疗前后外周血单核细胞NLRP3炎性体mRNA表达及血清IL-1β水平的研究*

丁焕发王尚云徐晓辰刘淑娟兰立强韦涌涛

急性痛风性关节炎患者治疗前后外周血单核细胞NLRP3炎性体mRNA表达及血清IL-1β水平的研究*

丁焕发①王尚云①徐晓辰①刘淑娟①兰立强①韦涌涛①

【摘要】目的：检测急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis，AGA）患者治疗前后外周血单核细胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）中NLRP3炎性体［NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）］mRNA表达水平及血清白介素-1β（IL-1β）水平的变化，探讨该炎性体及IL-1β 在AGA发病中可能的作用机制。方法：用RT-PCR法检测100名健康查体者（对照组）和100例AGA患者（观察组）治疗前（D0）及应用药物治疗后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）NLRP3炎性体mRNA表达水平，同时用ELISA法测定相应IL-1β水平。比较两组患者生理指标和血生化指标的差异。结果：观察组NLRP3 mRNA表达水平D0、D3及D7与对照组比较均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；观察组各阶段ASC mRNA表达水平与对照组比较均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；观察组caspase-1 mRNA表达水平，D0和D3与对照组比较均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。观察组血清IL-1β水平在D0、D3、D7与对照组比较均升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论：NLRP3炎性体及IL-1β在AGA患者治疗过程中水平异常，提示其在AGA发病中参与了炎症反应过程，在炎症机制中可能发挥了重要作用。

【关键词】凋亡相关斑点样蛋白； 半胱天冬酶-1； NLRP3； 炎性体； 痛风性关节炎

First-author’s adress：Qingdao Eighth People’s Hospital，Qingdao 266100，China

随着社会的发展，人们的生活水平、饮食结构及社交行为方式发生了很大的改变，同时人类寿命也在延长，痛风的患病率逐年上升，急性痛风性关节炎（AGA）患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势，且常伴有糖尿病、肥胖、心脑血管病、肾脏病等，发病高峰年龄为40岁左右，临床上以男性患者多见，女性约占5%［1］，且多为绝经期后妇女。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用，其中IL-1β是单钠尿酸盐（MSU）晶体诱导炎症的关键因子，NLRP3炎性体通过促进IL-1β的生成在AGA发作中发挥不可替代的作用［2］。本研究即对此进行研究、探讨，以期发现NLRP3炎性体及IL-1β在AGA启动、进展及缓解的各个阶段表达水平的变化及意义，指导AGA的早期防治及优化治疗方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料 观察组：选取2014年8月-2016年2月本院门诊患者100例，男95例，女5例，年龄（47.25±10.99）岁，均符合以下诊断标准和剔除标准，（1）急性痛风性关节炎诊断标准：应用美国风湿病协会（ACR）1997年制定的诊断标准。（2）入选和排除标准：①符合ACR诊断标准的急性原发性痛风性关节炎；②排除心血管、肾脏、血液疾病、肿瘤疾病引起的继发性痛风；③排除合并感染性疾病患者；④排除自身免疫性疾病及全身系统疾病患者；⑤年龄18～75岁；⑥一般情况良好；⑦未服用降尿酸药物治疗者。对照组：随机选取青岛本地居民健康查体者100例，男95例，女5例，年龄（46.15±11.80）岁，排除高尿酸血症患者。高尿酸血症的诊断标准：在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血清尿酸水平（37 ℃）男性＞420 μmol/L，绝经前女性＞360 μmol/L，绝经后女性的诊断标准同男性。本研究得到本院伦理委员会批准，所有研究对象均知情同意。两组研究对象的一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法 AGA发病时的一线镇痛药物包括非甾体类消炎药（NSAIDs）、COX-2抑制剂、秋水仙碱或类固醇药物，首选秋水仙碱及NSAIDs，通过降低患者血清及关节液中IL-1β、TNF-α、环氧化酶-2等的水平发挥作用［3-5］。治疗方案：在低嘌呤饮食、足量饮水前提下，进行如下治疗，（1）镇痛：为主要治疗措施。秋水仙碱片，服药疗程14 d：前3 d 0.5 mg/次，3次/d，餐后服；后0.5 mg/次，2次/d，餐后服，连续用药7 d；后4 d 0.5 mg/次，1次/晚，睡前服。依托考昔片，服药疗程10 d：前3 d 120 mg/次，1次/d，餐后服；3 d 后60 mg/次，1次/d，餐后服，连续用药7 d［6-9］。（2）碱化尿液：抑制尿酸在肾脏形成晶体，促进尿酸肾脏排泄。尿pH值维持在6.2～6.8。口服枸橼酸钾钠颗粒（逍适柠）2.5 g/次，4次/d（三餐后及睡前）。治疗中若出现肝、肾功能异常及胃肠道反应则予以排除。

1.3 观察指标

1.3.1 测定两组一般生理指标 年龄（Age）、身高（BH）、体重（BW）、收缩压/舒张压（SBP/DBP）、腰围（WC）、臀围（HC）。计算腰臀比（WHR）及体质量指数（BMI）。BMI=体重（kg）/身高（m）2。

1.3.2 测定两组血生化指标 空腹血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、C-反应蛋白（CRP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）；测定两组全血白细胞总数（WBC）、中性粒细胞数（NEUT）、中性粒细胞百分比（NEUT%）。

1.3.3 测定两组NLRP3炎性体mRNA和血清IL-1β水平 观察组治疗前（第0天，D0）及治疗后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）PBMCs 中NLRP3 mRNA、ASC mRNA及 caspase-1 mRNA。测定相应时间点的空腹血清IL-1β水平。同时测定对照组上述指标，与观察组治疗前进行比较。

1.4 检测方法 所有入选者由专人进行一般生理指标测量并记录。实验中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Cr、BUN的检测用全自动生化分析仪，IL-1β的检测采用ELISA试剂盒。PBMCs中NLRP3、ASC及caspase-1 mRNA采用RT-PCR检测。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自动血液分析仪检测。

1.5 统计学处理 本研究采用IBM SPSS 19.0统计学软件包对所有数据进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料的比较采用 χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料及生化指标比较 两组性别、年龄、AST比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、C-RP、WBC、NEUT、NEUT%均明显升高，HDL-C降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 两组NLRP3炎性体mRNA水平比较 观察组NLRP3 mRNA表达水平D0、D3及D7与对照组比较均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），D14与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；观察组各阶段ASC mRNA表达水平与对照组比较均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；观察组caspase-1 mRNA表达水平，D0及D3与对照组比较均降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），D7及D14与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 两组一般资料及生化指标比较（±s）

表1 两组一般资料及生化指标比较（±s）

组别 性别 例 年龄（岁）BH （cm）BW （kg）BMI （kg/m2）SBP （mm Hg）DBP （mm Hg）WC （cm）男女观察组（n=100） 95 5 47.25±10.99 171.97±5.61*79.76±11.01*26.87±3.54*138.96±14.90*88.24±11.22*96.77±8.29*对照组（n=100） 95 5 46.15±11.80 162.82±6.34 65.08±9.71 24.48±2.87 132.61±16.74 83.65±8.95 87.10±8.90

续表1

续表1

表2 两组NLRP3炎性体 mRNA水平比较（±s）

表2 两组NLRP3炎性体 mRNA水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.01，△P＜0.05

组别 时间 ASC mRNA csapase -1 mRNA NLRP3 mRNA观察组（n=100）D0 0.028±0.016*0.047±0.030*0.077±0.039*D3 0.030±0.020*0.052±0.030*0.086±0.046*D7 0.017±0.012*0.113±0.057 0.103±0.054*D14 0.013±0.007△0.124±0.066 0.123±0.078对照组（n=100） 0.011±0.006 0.119±0.061 0.130±0.070

2.3 两组IL-1β水平比较 观察组血清IL-1β 水 平 在D0、D3、D7分 别 为（62.41±13.68）、（51.34±12.10）、（24.62±5.51）pg/mL，与对照组的（15.56±4.02）pg/mL比较均升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；D14为（16.39±3.29）pg/mL与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

痛风是因嘌呤代谢障碍和/或尿酸排泄减少、血UA持续升高而导致MSU晶体析出并沉积于组织或器官引起的一组临床症候群，属于代谢性风湿病［10］。报道显示，国内痛风的患病率目前在1%～3%，2009年山东沿海地区当地居民痛风患病率为1.96%，2007-2008年美国痛风患病率上升至3.9%［11］。急性痛风性关节炎（AGA）可发生于任何年龄，发病高峰年龄为40岁左右，且常伴有糖尿病、肥胖、心脑血管病、肾脏病等，患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势。本研究中，与对照组相比，观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、均明显升高，HDL-C降低（P＜0.01），亦支持上述观点。AGA临床上以男性患者多见，女性约占5%［1］，且多为绝经期后妇女。AGA发作时疼痛剧烈，患者异常痛苦，严重影响日常工作和生活。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用，其中IL-1β是MSU晶体诱导炎症的关键因子，NLRP3炎性体通过促进IL-1β的生成在痛风发作中发挥不可替代的作用。

NLRP3炎性体，即Nod样受体蛋白3（Nodlike receptor protein 3，NLRP3）炎性体是位于细胞内的一种蛋白质复合体，主要功能为活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）以间接调控IL-1β、IL-18、和IL-33等的成熟和分泌，具有调控机体炎症反应的功能［12］。NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族成员NLRP3（NLR family，pyrin domain containing 3）、 凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1）组成的复合体，是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器，是活化caspase-1的分子平台，调控IL-1β和白介素18（IL-18）等促炎细胞因子的成熟和分泌。IL-1β是一个经典的促炎性细胞因子，活化的IL-1β与靶细胞上的IL-1受体结合，激活IL-1信号通路和髓样分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）依赖的NF-κB通路，促进IL-1等促炎因子转录，诱导机体炎症反应。IL-1β是促进多种代谢性疾病发生发展的重要炎症因子，阻断其生物学效应能有效缓解代谢性疾病的进展。NLRP3是模式识别胞内受体Nod样受体蛋白家族的成员，广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞，具有识别病原体的功能。ASC是NLRP3炎性体的双重衔接蛋白，能够以某种桥梁的形式将NLRP3和caspase-1前体连接起来，最终形成具有酶活性的异二聚体caspase-1。caspase-1作为炎性体的效应蛋白，能够将无活性的IL-18和IL-1β前体剪切为成熟的IL-18和IL-1β，促进其成熟分泌。

目前研究认为，NLRP3炎性体是MSU 导致痛风的核心机制。Martinon等［13］研究显示，NLRP3介导MSU诱导痛风发生发展，其机制可能与MSU诱导K+外流有关，还可能与线粒体来源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）释放有关，溶酶体破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小体的机制之一。本研究结果显示，AGA发病时及治疗后第3天，ASC mRNA表达水平均高于对照组（P＜0.05）；NLRP3 mRNA及caspase-1 mRNA表达水平均低于对照组（P＜0.01），说明在炎症早期，NLRP3炎性体参与了疾病过程。治疗后第7天，患者NLRP3 mRNA表达水平仍低于对照组（P＜0.01），ASC mRNA表达水平仍高于对照组（P＜0.01），caspase-1 mRNA表达水平与对照组无明显差异，提示在炎症持续存在期间，NLRP3炎性体持续参与炎症过程，随病程进行，炎症消退过程中，抑制炎症的调控因素可能逐渐出现。治疗第14天ASC mRNA表达水平仍高于对照组（P＜0.05），较前已明显降低，NLRP3 mRNA及caspase-1 mRNA表达水平与对照组无明显差异，结果显示AGA炎症消退，趋于正常，ASC表达可能存在其他途径及意义。

AGA的前炎症介质来源于常驻的滑膜细胞和迁移的单核巨噬细胞，而NEUT的侵入和活化是最重要的环节。发病时关节滑液和滑膜中出现的大量NEUT甚至可与急性化脓性关节炎时相当［14］。本研究中，发病时的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均显著高于对照组，提示AGA发病时WBC及NEUT在炎症初期就参与了反应。

IL-1β已被确定为MSU晶体诱导炎症的关键因子，其变化与痛风的发作及预后密切相关［15］。研究发现，AGA患者发病时血清及关节积液中IL-1β水平等显著升高［16-17］。IL-1β对细胞和组织有多种作用。IL-1β是IL-1可溶型。IL-1主要由单核巨噬细胞所产生，也能由中性粒 细胞合成，分为膜结合型（IL-α）和可溶型（IL-β）两种。IL-1多存在于血液和组织中。其生物学活性包括活化巨噬细胞、粒细胞并增强其活性；刺激单核/巨噬细胞等合成IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α；致炎症反应等。IL-1β在滑膜、滑液、软骨等关节组织中均有它的活性形式被发现，并被认为是最经典的炎症调节剂，是炎症调节的始动因素。AGA时，MSU及UA激活NLRP3炎性体，上调IL-β表达，促进AGA患者炎症反应发生、进展［18-19］。本研究结果中发现，观察组血清IL-1β水平在AGA发病时、治疗后第3天、治疗后第7天均高于对照组（P＜0.01），治疗后第14天无明显差异（P＞0.05），提示IL-1β在炎症发生、进展阶段表达加速，随着病情好转，炎症缓解、消退而表达减少，提示IL-1β在AGA发病机制中发挥及其重要的作用［20］。

总之，本研究结果表明，NLRP3炎性体及IL-1β在AGA患者发病及治疗过程中水平异常，提示其在AGA发病中参与了炎症反应过程，在炎症机制中可能发挥了重要作用。结果亦提示，NLRP3炎性体及IL-1β在炎症过程中存在负向调节，其在炎症发生、进展及缓解中的负面作用亦可能存在，需要在今后的研究中进一步探讨。

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.20.002

收稿日期：（2016-06-02） （本文编辑：蔡元元）

*基金项目：青岛市卫生科技发展计划项目（2014-WJZD103）①山东省青岛市第八人民医院 山东 青岛 266100

通信作者：丁焕发

Expression of NLRP3 Inflammasome mRNA in PBMCs and Serum Level of IL-1β of Patients with Acute Gouty Arthritis in the Course of Disease Process

DING Huan-fa，WANG Shang-yun，XU Xiao-chen，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（20）：005-009

【Abstract】Objective：To study the expression level of NLRP3 （NLR family，pyrin domain containing 3）inflammasome （NLRP3，ASC，caspase-1） mRNA in peripheral blood monocytes （PBMCs） and serum level of interleukin-1β （IL-1β） of patients with acute gouty arthritis （AGA） in the course of it，and the roles of them in pathogenesis in AGA.Method：NLRP3 inflammasome mRNA was measured using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） in PBMCs.The expression of NLRP3 inflammasome mRNA in PBMCs was compared between patients with AGA（T，n=100 ） and healthy controls（C，n=100）.T consisted of four stages of disease process：pretherapy （D0），the 3rdday after medications（D3），the 7thday after medications（D7） and the 14thday after medications（D14）.IL-1β was measured accordingly using Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） in the two groups.The differences of two group’s observation indexs were compared.The statistical data were analyzed by IBM SPSS 19.0 software.Result：The expression of NLRP3 mRNA in D0，D3 and D7 reduced significantly when compared to C（P＜0.01）.The expression of ASC mRNA in AGA increased significantly when compared to C（P＜0.05）.The expression of caspase-1 mRNA in D0 and D3 reduced significantly when compared to C（P＜0.01）.Serum level of IL-1β in D0，D3 and D7 increased significantly when compared to C（P＜0.01）.Conclusion：Dysregulated expression of the NLRP3 inflammasome and IL-1β level are involved in the inflammatory response and play key roles in the pathogenesis of the process of AGA.

【Key words】Apoptosis-associated speck-like protein； Caspase-1； NLRP3； Inflammasome；Acute gouty arthritis