宫颈鳞癌整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的表达及生物学行为

王　闯　王明娟　王一帆　齐洁敏

(承德医学院病理教研室，河北　承德　067000)



宫颈鳞癌整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的表达及生物学行为

王闯王明娟王一帆齐洁敏

(承德医学院病理教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的探讨宫颈鳞癌组织中整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白的表达及临床意义。方法应用组织芯片技术结合免疫组化方法(SP法)检测68例宫颈鳞癌组织和20例宫颈正常组织整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白表达情况，分析两者在宫颈鳞癌组织中的表达相关性及生物学行为。结果宫颈鳞癌组织整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的阳性表达率分别为77.9%和72.1%，均高于正常宫颈组织(P<0.05)；整合素α5β1、HPA蛋白均与宫颈鳞癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移和浸润深度显著相关；整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达呈现正相关性(r=0.594)。 结论整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白高表达与宫颈鳞癌的发生、发展有关，具有正协同作用，并可作为判断宫颈鳞癌浸润、转移及预后的预测因素。

〔关键词〕宫颈鳞癌；整合素α5β1；乙酰肝素酶；组织芯片

宫颈鳞癌为女性常见的恶性肿瘤之一，目前临床90%就诊患者均处于进展期，即确诊时已发生不同程度的局部浸润或转移。寻找宫颈鳞癌的早期诊断指标和找到特异性作用途径来抑制浸润或转移，已经成为研究的重点和热点。整合素α5β1 主要通过调节细胞黏附和迁移,能显著提高肿瘤的转移能力。乙酰肝素酶(HPA)能破坏细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)促进肿瘤浸润、转移。所以作为细胞黏附分子的整合素α5β1以及能够破坏ECM和BM的HPA在肿瘤浸润、转移过程中的作用非常重要〔1〕。目前国内对宫颈鳞癌组织中整合素α5β1、HPA的相关性研究未见报道。本项目采用高通量、多样本分析的组织芯片技术结合免疫组化检测的方法检测宫颈鳞癌。

1资料与方法

1.1一般资料采集2011年8月至2014年4月，承德医学院附属医院、承德医学院附属第二医院及266医院手术切除并经病理专家诊断确诊为宫颈鳞癌组织68例，正常宫颈组织20例,平均年龄64岁。每例患者术前均未行各种激素治疗及放疗、化疗。所有病例临床病理资料完整，标本均进行连续切片，片厚5 μm。

1.2实验试剂整合素α5β1蛋白和HPA蛋白免疫组化试剂盒(北京Bioss生物技术有限公司)、0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液、二氨基联苯胺(DAB)显示剂。

1.3组织芯片的构建将需要的组织在HE切片上标出，用组织芯片仪吸针从供体蜡块取出组织，按照预先设计好的顺序排列，装载在受体蜡块中，每例组织都可重复装载，以保证芯片中组织的代表性，并且可避免组织脱片造成的信息丢失。受体蜡块制备好后，连续5 μm切片粘贴于经过APES处理过的玻片上。

1.4免疫组化采用免疫组化SP法同步检测整合素α5β1和HPA蛋白的表达情况，一抗为小鼠抗整合素α5β1和HPA抗体。用PBS代替一抗作为阴性对照，由试剂公司提供阳性切片作为阳性对照。

1.5结果判定整合素α5β1蛋白表达主要分布于细胞质和细胞膜，而HPA蛋白表达主要存在于细胞质内，以出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。采用双评分半定量法进行评分：靶细胞的阳性率<25%为0分，25%～50%为1分，51%～75%为2分，>75%为3分；染色反应的深度计分为0～3分，其中染色深度以多数细胞的呈色反应为准，不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分。并根据这两项的计分之和分为4级即：阴性(-)为0分，弱阳性(+)为1～2分，阳性()为3～4分。强阳性()为5～6分。

1.6统计学处理采用SPSS13.0统计软件行χ2检验、Spearman等级相关分析。

2结果

2.1整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宫颈鳞癌和正常宫颈组织中的表达情况宫颈鳞癌组织中整合素α5β1蛋白阳性率明显高于宫颈正常组织(P<0.05)。宫颈鳞癌组织中HPA蛋白的阳性率明显高于宫颈正常组织(P<0.05)。见图1，图2，表1。

图1　宫颈鳞癌及宫颈正常组织整合素α5β1蛋白的表达(DAB，×200)

图2　宫颈鳞癌及宫颈正常组织HPA蛋白的表达(DAB，×200)

组织n染色结果-+阳性率(%)HPA染色结果-+阳性率(%)宫颈鳞癌组织68159172777.91)1911211772.11)癌旁正常组织201730015.01622020

与癌旁正常组织比较：1)P<0.05

2.2宫颈鳞癌组织中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的临床生物学行为关系 整合素α5β1和HPA蛋白在宫颈鳞癌非角化型组的表达都高于角化型组的表达，两组间差异显著(P<0.05)。临床分期Ⅲ、Ⅳ期组整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表达都明显高于Ⅰ、Ⅱ期组，分期越高表达越强(P<0.05)。有淋巴结转移组整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表达明显都高于无淋巴结转移组(P<0.05)。浸润深肌层组整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表达都明显高于浅肌层组(P<0.05)。见表2。

表2　宫颈癌组织中整合素α5β1 和 HPA临床生物学行为关系〔n(%)〕

2.3宫颈鳞癌组织中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白表达的相关性68例宫颈鳞癌组织中α5β1蛋白和HPA蛋白表达强度呈明显正相关(r=0.594，P<0.01)，即宫颈鳞癌组织中整合素α5β1表达愈强，HPA蛋白表达愈强，反之亦然，即：整合素α5β1和HPA在宫颈鳞癌的发生、发展过程中具有正协同作用。见表3。

表3　整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宫颈鳞癌组织中的相关性(n)

3讨论

整合素α5β1是由α5和β1两亚基结合而成的异二聚体。整合素α5β1是一类很重要的细胞表面受体，其配体是细胞外基质蛋白的组成成分之一纤黏连蛋白(FN)，主要介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间的黏附，在肿瘤的发生发展和浸润、转移过程中都起着重要作用〔2〕。研究发现在许多恶性肿瘤组织中均有整合素α5β1的异常表达,整合素α5β1在胃癌〔3〕、肺癌〔4〕、肝癌〔5〕、肠癌〔6〕、胆囊癌〔7〕等肿瘤细胞中都有表达。迟福生等〔8〕研究贲门癌组织中整合素α5β1 mRNA的表达及其与临床病理特征的关系，发现贲门癌组织中整合素α5β1 mRNA的表达明显高于癌旁正常胃黏膜组织，并且与癌组织淋巴结转移及病理分期呈正相关，与癌组织分化程度呈负相关。李桃等〔3〕免疫组化方法检测结果：整合素α5β1在胃癌中的表达明显高于正常胃黏膜,这与本实验结果相一致。整合素α5β1蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及意义的研究在国内未见报道。本实验采用组织芯片技术结合免疫组化SP法从蛋白水平上检测整合素α5β1蛋白在宫颈鳞癌及正常宫颈组织中的表达情况,宫颈鳞癌的表达明显高于宫颈正常组织，说明整合素α5β1蛋白与宫颈鳞癌发生有关。整合素α5β1蛋白与宫颈鳞癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度有密切联系，提示整合素α5β1蛋白参与了宫颈鳞癌的发生及浸润、转移过程。

完整的BM可以限制癌细胞的浸润和转移，癌细胞必须突破BM才能向远处浸润、转移，因此能够降解ECM及BM的物质与肿瘤的浸润、转移密切相关。HPA是迄今为止人体内的唯一能够在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的酶，破坏ECM和BM促进肿瘤浸润、转移。HPA的正常表达仅限于胎盘和免疫器官，而在恶性肿瘤细胞中尤其在高侵袭力恶性肿瘤细胞中，都有HPA的异常高表达。苏宁等〔9〕研究HPA在肝细胞癌及胃癌中的表达及其临床意义，结果发现HPA在肝细胞癌和胃癌中的过表达。姜维华等〔10〕研究发现HPA在胃癌中高表达，且与肿瘤组织学分级、TNM分期、淋巴结转移相关，与本实验结果相符。用组织芯片结合免疫组化技术研究宫颈鳞癌未见报道。本实验通过组织芯片结合免疫组化技术检测到HPA在宫颈鳞癌组织中过表达，和正常宫颈组织相比有明显的差异，说明HPA在宫颈鳞癌的发生过程中有着非常重要的作用。HPA蛋白的表达与分化程度、淋巴结转移、浸润深度及临床分期都有关，这些也提示我们，HPA蛋白也参与了宫颈鳞癌浸润、转移的过程。

整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达的相关性未见报道，本实验通过组织芯片结合免疫组化技术结果显示，整合素α5β1、HPA在宫颈鳞癌的发生、发展中起着正协同作用。有理论认为〔11〕：可将肿瘤浸润、转移过程主要分成三步：黏附、降解和移动。整合素α5β1是一种黏附因子，它的过表达可以使得肿瘤细胞与BM、ECM间的黏附增高，而HPA人体内的唯一能够在特定部位裂解HSPG的酶，能够降解ECM和BM，因此整合素α5β1的黏附作用和HPA的基质降解作用在宫颈鳞癌的浸润、转移过程中是相互配合共同作用完成。

综上，通过组织芯片技术结合免疫组化同步检测整合素α5β1、HPA蛋白在正常宫颈组织和宫颈鳞癌组织中的表达情况，从而进一步说明整合素α5β1、HPA在宫颈鳞癌发生、发展中起着重要的作用，并且二者起正协同作用，为探讨宫颈鳞癌的浸润、转移及预后的关系，以及为宫颈鳞癌的早期诊断提供新线索，并且可以为宫颈鳞癌的临床治疗提供理论基础。

4参考文献

1金春亭.四种细胞黏附分子在老年宫颈癌浸润中的作用〔J〕.中国老年学杂志,2007；27(18):1796-8.

2Giancotti FG,Ruoslahti E.Integrin signaling〔J〕.Science,1999;285(5430):1028-32.

3李桃，齐洁敏.整合素α5β1和乙酰肝素酶在胃癌中的表达及意义〔J〕.广东医学，2012;33(19)：2974-6.

4韩其政，郭其森，贾慧，等.整合素α5β1与CD44s在非小细胞肺癌中表达的意义〔J〕.现代肿瘤学，2007;15(11)：1563-6.

5Su JM，Wang LY，Liang YL，etal.Role of cell adhesion signal molecules in hepatocellular carcinoma cell apoptosis〔J〕．World J Gastroenterol，2005;11(30)：4667-73．

6李智,李剑,万相斌,等.E-cadherin 和整合素α5β1 的表达与结直肠癌生物学行为和预后的关系〔J〕.新医学,2011;42(4):227-30.

7王鲁，蔡端，许祖德，等.粘附分子整合素α5β1在胆囊癌中的表达及其临床意义〔J〕.中华实验外科杂志，2000;17(1)：18-9.

8迟福生,王振元,王者生.贲门癌组织整合素α5β1mRNA表达及其临床病理意义〔J〕.中华肿瘤防治杂志,2010;17(10):752-4.

9苏宁,陈斌,陈锦章,等.乙酰肝素酶在肝细胞癌及胃癌中的表达及其临床意义〔J〕.实用医学杂志,2009;25(8):1207-9.

10姜维华,朱辛明,杨志平,等.乙酰肝素酶在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系〔J〕.中国老年学杂志,2011;31(17):3262-3.

11孙靖中，邹雄.肿瘤分子生物学〔M〕.北京：人民卫生出版社，1998:312-8.

〔2014-12-09修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：河北省计生委指令性课题 (2012-A21)

通讯作者：齐洁敏(1966-)，女， 教授， 硕士生导师，主要从事生殖系统肿瘤研究。

〔中图分类号〕R737.33

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3131-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.016

第一作者：王闯(1986-)，女，硕士，主要从事生殖系统肿瘤研究。