5-ASA对炎症性肠病大鼠结肠组织中TGFβ1/smads信号通路的影响

殷　勤，施会敏，曲高婷，张爱青，甘卫华

(南京医科大学第二附属医院　儿科，江苏　南京　210003)



·基础医学·

5-ASA对炎症性肠病大鼠结肠组织中TGFβ1/smads信号通路的影响

殷勤，施会敏，曲高婷，张爱青，甘卫华

(南京医科大学第二附属医院儿科，江苏南京210003)

【摘要】目的：应用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠结肠炎模型研究TGFβ1/smads信号途径在5-氨基水杨酸(5-ASA)抗炎过程中的作用。方法：80只Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组(n=20)、造模组(n=20)、TNBS+5-ASA口服组(n=20)、TNBS+5-ASA灌肠组(n=20)，采用疾病活动指数、大体评分和组织学评分评价TNBS诱导结肠炎的严重程度，通过RT-PCR和Western blot检测TGFβ1、smad2、smad3、smad4和smad7 mRNA和蛋白的表达量。结果：造模组smad2、smad3、smad4 mRNA和蛋白表达量明显下降，而smad7的mRNA和蛋白表达量明显升高。5-ASA口服和灌肠均可以上调smad2、smad3和smad4 mRNA和蛋白表达，下调smad7的mRNA和蛋白表达，且5-ASA灌肠均优于5-ASA口服。结论：5-ASA可能通过调节TGFβ1/smads途径的信号转导来改善肠黏膜炎症。

【关键词】TGFβ1；smads；5-氨基水杨酸；炎症性肠病

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.003

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一类以反复发作和缓解为临床特征的肠黏膜慢性炎症性疾病[1-2]。5-氨基水杨酸(5-ASA)是治疗炎症性肠病的主要药物之一[3]。转化生长因子β(transforming growth factor β,TGFβ)是一类分泌型多肽类生长因子，TGFβ/smads信号途径在细胞及生物体的生长和发育过程中起重要作用，而且与上皮间质转化(EMT)密切相关。目前已知在炎症性肠病中有TGFβ/smads信号途径的参与[4]，而关于5-ASA是否能够调节炎症性肠病中的TGFβ/smads信号途径，从而改善肠黏膜炎症及损伤却鲜有报道，本文应用TNBS诱导大鼠结肠炎模型并给予5-ASA治疗，初步探讨TGFβ/smads信号途径在5-ASA抗炎过程中的作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物6～8周龄SPF级健康Sprague-Dawley大鼠80只，体质量150～180 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.1.2药物与试剂TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7、GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology，TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7、GAPDH引物由上海生工生物工程设计合成。TNBS购自美国Sigma公司。5-ASA口服剂(美沙拉秦缓释颗粒剂，艾迪莎)产自法国爱的发制药集团。5-ASA灌肠剂(莎尔福灌肠液)产自瑞士Vifor AG Zweigniederlassung Medichemie Ettingen。

1.2实验方法

1.2.1造模与取材大鼠饲养于上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验前适应性饲养1周，饲养条件为：温度(22±2)℃，湿度(55±5)%，正常饮食。实验前一天禁水不禁食、24 h后随机分为四组：对照组(n=20)、TNBS组(n=20)、TNBS+5-ASA口服组(n=20)、TNBS+5-ASA灌肠组(n=20)。实验第1天，将5%TNBS和无水乙醇以体积比1∶1混合制成含2.5 mg/mL TNBS的50%乙醇溶液(造模液)，给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠1 mL/kg体质量麻醉。取蝶翼采血针，剪去针头，取其后软管，一端接上1 mL注射器，另一端涂上石蜡油后从肛门插入肠道，TNBS组、TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组给予100 mg/kg体质量的造模液，对照组给予等体积的50%乙醇，在距离肛门8～10 cm处灌肠，灌好后拔出软管，保持大鼠头朝下倒立30 s左右，以保证混合液到达全部结肠。造模完成后，大鼠平卧至清醒，饲养于SPF级环境，给予正常饮食，每日观察其精神状态、进食、活动和大便性状等，并记录其体质量。每天取其粪便做隐血试验。实验第3天开始TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组分别给予100 mg/kg 5-ASA口服和灌肠，实验第8天处死所有大鼠，取结肠组织并分成三部分，一部分置于冻存管中-70 ℃保存用于提取RNA，一部分置于冻存管中-70 ℃保存用于提取蛋白，剩余的组织放入4%多聚甲醛中进行固定，石蜡包埋后制备组织切片(厚度4 μm)。

1.2.2TNBS诱导的结肠炎严重程度评估每日记录大鼠体质量变化，观察大便性状，检测大便隐血，按照Murthy等[5]制定的标准进行疾病活动指数(disease activity index scores,DAI)评分[6]。取材时肉眼观察肠黏膜有无损伤、充血水肿及溃疡，对结肠进行大体评分(colon macroscopic damage index,CMDI)，参考Wallace JL制定的标准[7]。光学显微镜下观察结肠白细胞浸润程度、杯状细胞形态、血管密度及肠壁厚度，进行组织学评分(histopathological score,HPS)，参考Lahat G的评分标准[8]。

1.2.3RT-PCR提取大鼠结肠组织RNA并进行逆转录，逆转录条件为 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，所得到的cDNA在Mastercycler ep realplex4 PCR系统上进行RT-PCR反应，反应条件为95 ℃预变性1 min，随后40个循环的95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。GAPDH作为内参。TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7、GAPDH的引物序列见表1。

表1PCR引物序列

引物序列TGFβ1上游5'-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3'下游5'-TCAAAAGACAGCCACTCAGG-3'smad2上游5'-AAGCCATCACCACTCAGAATTG-3'下游5'-CACTGATCTACCGTATTTGCTGT-3'smad3上游5'-GGTGTGCGGCTCTACTACATT-3'下游5'-CTGGTCACTGTCTGTCTCCTGT-3'smad4上游5'-AGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'下游5'-TTGGTGGATGTTGGATGGTT-3'smad7上游5'-GGTGCTCAAGAAACTCAAGGAG-3'下游5'-AGTAAGGAGGAGGGGGAGACT-3'GAPDH上游5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'下游5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'

1.2.4Western blot提取大鼠结肠组织总蛋白并测定蛋白浓度，每个样品加40 mg蛋白进行SDS-PAGE电泳，320 mA 90 min转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃孵育TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7一抗过夜，然后室温孵育二抗2 h，加显影液后曝光，GAPDH作为内参。

2结果

2.1TNBS诱导的结肠炎严重程度评估TNBS组大鼠在灌肠后出现厌食、懒动、竖毛，体质量明显减轻，糊状或水样的肉眼血便，并带有较多的黏液和脓液；对照组大鼠仅在实验第1～2天出现轻度厌食、倦怠和稀便，体质量无减轻，粪便不带有黏液和脓血；TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组出现轻度体质量下降、厌食和懒动，粪便糊状，无肉眼血便但粪便隐血试验阳性，无黏液和脓液，其中5-ASA灌肠组略好于5-ASA口服组。期间各组体质量数据见表1。从实验第3天开始，TNBS组大鼠的DAI评分明显增高，且维持在高水平，而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组的DAI评分显著低于TNBS组(图1A)。TNBS组大鼠结肠与周围组织器官粘连明显，不易分离，剖开结肠后可见明显充血水肿、出血、糜烂和散在溃疡形成，重者可见坏死，肠壁显著增厚；而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组大鼠结肠与周围组织粘连较轻，结肠壁有明显充血水肿、出血和糜烂，但无溃疡形成，亦无坏死；TNBS组、TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组的CMDI评分均高于对照组，而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组低于TNBS组，其中5-ASA灌肠组低于5-ASA口服组(图1C)。组织病理结果显示TNBS组大鼠结肠黏膜上皮损伤、缺失、糜烂及溃疡形成，固有层腺体变形、排列紊乱，黏膜及黏膜下层见密集分布的淋巴细胞，单核细胞及中性粒细胞浸润，而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组大鼠结肠黏膜上皮有轻度的损伤、缺失和糜烂，但无溃疡形成，黏膜及黏膜下层淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润少于TNBS组，肠壁厚度也小于TNBS组(图1B)；TNBS组HPS评分较对照组升高，而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组均低于TNBS组，但5-ASA口服组和5-ASA灌肠组之间无统计学差异(图1D)。

A.各组大鼠每日DAI评分；B.各组大鼠结肠组织HE染色(100×)；C.各组大鼠CMDI评分；D.各组大鼠HPS评分。

*与对照组比较P<0.05，#与TNBS组比较P<0.05，&与TNBS+5-ASA口服比较P<0.05。

图1TNBS诱导的结肠炎严重程度评估

表2　各组大鼠体质量变化　g

*与对照组比较P<0.05，#与TNBS组比较P<0.05。

2.2RT-PCR检测TNBS诱导的结肠炎以及5-ASA治疗后结肠组织中TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7的表达RT-PCR检测结果显示四组的TGFβ1 mRNA表达量无统计学差异(图2A，P>0.05)；TNBS组的smad2、smad3和smad4 mRNA的表达量均低于对照组(图2B～D，P<0.05)，TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组的smad2、smad3和smad4 mRNA的表达量较TNBS组升高，而TNBS+5-ASA灌肠组高于TNBS+5-ASA口服组(图2B～D，P<0.05)；TNBS组的smad7 mRNA的表达量较对照组升高(图2E，P<0.05)，而TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组比TNBS组降低，但是两组之间无统计学差异(图2E，P<0.05)。

2.3Western blot检测TNBS诱导的结肠炎以及5-ASA治疗后结肠组织中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7的表达Western blot检测结果显示四组的TGFβ1和smad2/3蛋白表达量无统计学差异；而TNBS组的p-smad2/3和smad4蛋白表达量低于对照组，TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组均比TNBS组升高，TNBS+5-ASA口服组和TNBS+5-ASA灌肠组之间无统计学差异；smad7蛋白在TNBS组的表达量高于对照组，而口服5-ASA和5-ASA灌肠后其表达量均下降，其中5-ASA灌肠组低于5-ASA口服组(表3、图3)。

*与对照组比较P<0.05，#与TNBS组比较P<0.05，&与TNBS+5-ASA口服比较P<0.05。

图2TNBS诱导的结肠炎以及5-ASA治疗后结肠组织中TGFβ1、smad2、smad3、smad4、smad7 mRNA的表达

表3TNBS诱导的结肠炎以及5-ASA治疗后结肠组织中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7蛋白的表达量

组别TGFβ1smad2/3p-smad2/3smad4smad7对照组0.148±0.0932.633±0.9811.002±0.0922.116±0.8890.738±0.233TNBS组0.139±0.0682.750±0.7980.303±0.167*0.601±0.734*3.075±0.841*TNBS+5-ASA口服组0.124±0.0122.459±0.0671.527±0.872#1.018±0.336*#1.368±0.747#TNBS+5-ASA灌肠组0.126±0.0662.974±1.2341.342±0.374#1.315±0.454#0.681±0.446#&F值0.170.367.465.9619.73P值0.91330.78360.00150.00450.0000

*与对照组比较P<0.05，#与TNBS组比较P<0.05，&与TNBS+5-ASA口服组比较P<0.05。

1：对照组；2：TNBS造模组；3.TNBS+5-ASA口服组；4：TNBS+5-ASA灌肠组。

图3TNBS诱导的结肠炎以及5-ASA治疗后结肠组织中TGFβ1、smad2/3、p-smad2/3、smad4、smad7蛋白的表达

3讨论

炎症性肠病是一组未知原因的肠黏膜慢性炎症性疾病。促炎性细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ等)与抗炎性细胞因子(如IL-4、IL-10、IL-13、TGFβ等)之间的失衡是引起肠黏膜损伤的重要因素[9]。

TGFβ/smads信号途径在细胞及生物体的生长和发育过程中起重要作用。在TGFβ1/smads信号途径中，TGFβ1与膜受体的结合导致TβRⅡ磷酸化并激活TβRⅠ，TβRⅠ可以磷酸化并激活smad2和smad3，而磷酸化的smad2和smad3协同smad4转位到细胞核中，调节靶基因的转录过程[10]。smad6、smad7可以竞争性地结合TβRⅠ，进而抑制TGFβ/smads途径的信号转导。

smad3在TGFβ1介导的抗炎作用中起重要的作用，干扰smad3导致细胞对TGFβ1的反应性减弱，而smad3缺陷小鼠胃肠道T细胞浸润明显增加并有脓肿形成[11]。阻断内源性TGFβ1的活性导致炎症因子的合成增加，说明TGFβ1在负调控人类肠道中炎症因子的合成中起关键作用[12]。smad6和smad7的上调与TGFβ/smads信号途径的抑制相关[10,13]，IBD病人肠黏膜组织和LPMCs中表达高水平的smad7。5-ASA是IBD的治疗药物之一，本研究应用TNBS诱导的大鼠结肠炎模型，并给予5-ASA口服和灌肠治疗，发现TNBS诱导的大鼠结肠炎中TGFβ1和总smad2/3并没有变化，但是p-smad2/3和smad4含量却显著下降，而smad7的表达明显升高，我们推测这种情况的出现可能是IBD导致抑制性smad7的表达升高，smad7可以竞争性结合TβRⅠ，阻止了TβRⅠ结合并磷酸化smad2和smad3，因此尽管TGFβ1和总smad2/3并没有变化，但是smad2/3磷酸化程度降低，从而抑制了TGFβ1/smads途径的信号转导，导致过度的炎症因子的合成与释放，抗炎因子与炎症因子的平衡失调，造成肠黏膜损伤。而应用5-ASA可以显著降低抑制性smad7的表达，解除了smad7对TβRⅠ的抑制作用，p-smad2/3和smad4的表达增加，激活TGFβ1/smads途径的信号转导，使得抗炎因子与炎症因子得以平衡，因而可以改善TNBS诱导的大鼠结肠炎的症状以及肠黏膜炎症。哺乳动物中TGFβ有TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3等三种异构体，TGFβ超家族还有其他众多成员，因此，虽然总TGFβ1没有变化，但可能存在其他分子的代偿性变化来调节smad2/3的磷酸化和TGFβ1/smads途径的信号转导，有待于进一步的研究。本研究还发现5-ASA灌肠组的效果要优于5-ASA口服组，这可能与5-ASA主要在肠黏膜局部发挥作用的特性有关。

综上所述，5-ASA对IBD的治疗作用除了通过调节炎性介质的合成和炎症细胞的功能以及清除反应性氧代谢产物之外，还可能通过调节TGFβ1/smads途径的信号转导来改善肠黏膜炎症，5-ASA与TGFβ1/smads信号途径激活剂协同治疗可能是IBD的治疗的新方向之一。

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文章编号：1002-0217(2016)04-0315-05

收稿日期：2016-01-27

作者简介：殷勤(1968-)，女，副主任医师，(电话)18951762773，(电子信箱)njyinqin@163.com;

【文献标识码】【中图号】R 574.62A

5-aminosalicylic acid relieves the intestinal inflammation through the TGFβ1/smads signaling pathway in animal model of inflammatory bowel disease

YIN Qin,SHI Huimin,QU Gaoting,ZHANG Aiqing,GAN Weihua

Department of Pediatrics,The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210003,China

【Abstract】Objective：To observe the effect of 5-aminosalicylic acid (5-ASA) on the TGFβ1/smads signaling pathway in 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)-induced colitis in rat models.Methods:Eighty Sprague-Dawley rats were equally randomized into control group,model group,TNBS+5-ASA(oral) and TNBS+5-ASA(enema) (n=20 for each).The severity of TNBS-induced colitis was assessed using the Disease Activity Index scores,Colon Macroscopic Damage Index and the Histopathological Score.Real-time PCR and western blot were then performed to examine the expression of TGFβ1,smad2,smad3,smad4 and smad7 in each group of rats.Results:Exposure to TNBS+ethanol resulted in a marked decrease in the mRNA and protein expression of smad2,smad3 and smad4,yet increase of smad7.Treatment with TNBS+5-ASA by oral or enema had up-regulated the mRNA and protein expression of smad2,smad3 and smad4,yet down-regulated the expression of smad7.Nevertheless,administration of 5-ASA by enema was superior to oral use in improving the intestinal inflammation and mucosal injury.Conclusion:5-ASA relieves the intestinal inflammation through the TGFβ1/smads signaling pathway in animal model of inflammatory bowel disease.

【Key words】TGFβ1;smads;5-ASA;inflammatory bowel disease

张爱青，男，副主任医师，(电子信箱)njaiqing@njmu.edu.cn，通信作者.