NLRP3在鼻咽癌中的表达及其临床意义

汤俊照，汪亦品

(1.宣城市中心医院　五官科，安徽　宣城　242000；2.南京医科大学　病理学与病理生理学系，江苏　南京　210029)



·临床医学·

NLRP3在鼻咽癌中的表达及其临床意义

汤俊照1，汪亦品2

(1.宣城市中心医院五官科，安徽宣城242000；2.南京医科大学病理学与病理生理学系，江苏南京210029)

【摘要】目的：探讨炎症小体NLRP3在鼻咽癌组织和正常鼻咽黏膜组织中的表达水平变化及其与患者临床预后的关系。方法：采用实时定量PCR和免疫组化检测40例鼻咽癌组织和12例正常鼻咽黏膜组织中NLRP3的表达水平。结果：①NLRP3在鼻咽癌组织中表达显著高于正常鼻咽黏膜组织 (P<0.05)；②在鼻咽癌患者中，NLRP3的表达水平与肿瘤的淋巴结转移以及患者的临床预后有关(P<0.05)，NLRP3高表达患者较低表达患者具有更好的局部无复发生存率和无瘤生存率，但与年龄和组织病理类型无明显相关关系(P>0.05)。结论：NLRP3具有提示鼻咽癌肿瘤转移及判断患者预后的价值。

【关键词】NLRP3；肿瘤转移；鼻咽癌；LRSF/DSF

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.04.021

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种侵袭性强的恶性肿瘤，恶性程度高，早期易发生淋巴结和全身远处转移，具有相当高的病死率，但其发生发展的机制目前尚不是很清楚[1]。

近年来，炎症-肿瘤的相关研究已成为肿瘤学研究重点，流行病学已证实至少25% 的人类恶性肿瘤与炎症和慢性感染有关[2]。研究发现，致炎因子水平升高与卵巢癌、头面部鳞状细胞癌、乳腺癌等各种肿瘤密切相关[3-6]。鉴于此,本研究采用实时定量PCR和免疫组化技术检测40例鼻咽癌组织和12例正常鼻咽黏膜组织中NLRP3的表达水平，旨在探讨NLRP3的表达水平与鼻咽癌之间的关系。

1资料与方法

1.1临床资料收集宣城市中心医院病理科2000年10月～2010年7月外科手术切除和存档的鼻咽癌组织40例，所有标本均常规经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋。40例患者中，男28例，女10例；年龄23～62岁，中位年龄43岁。按福州会议[7]进行临床分期：Ⅰ期5例、Ⅱ期13例、Ⅲ期16例、Ⅳ期6例；复发22例，无复发18例；中位随访时间60.5月，随访期间死亡6例。所有病例病理活检前均未行任何治疗。对照组12例正常鼻咽黏膜组织来自我院同期体检病例。52例中7例组织进行实时定量PCR检测。

1.2免疫组织化学染色 采用免疫组化染色SP法，按试剂盒操作步骤进行染色。NLRP3兔抗人多克隆抗体购自北京博鳌森生物技术公司，稀释度1∶50；SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自杭州碧云天生物技术公司。光镜下肿瘤细胞出现棕黄色着色者判定为阳性，并用0、1、2和3分别代表阴性、弱阳性、中等阳性、强阳性。蛋白表达量由阳性信号着色强度的量化得分进行判定，其中弱阳性代表低表达，中等阳性、强阳性代表高表达。

1.3实时定量PCR采用Primer 3.0在线设计来设计实时定量PCR引物，遵循跨内含子的原则，以避免非特异性及引物二聚体产生，委托上海Invitrogen公司合成(见表1)。

表1PCR引物序列

名称引物序列GAPDHF:5'-GTCTTCACTACCATGGAGAAGG-3'R:5'-TCATGGATGACCTTGGCCAG-3NLRP3F:5'-GTGGTGACCCTCTGTGAGGT-3'R:5'-TCTTCCTGGAGCGCTTCTAA-3'

采用TRIZOL一步法抽提细胞及组织的总RNA，取1 μg总RNA 进行逆转录反应，采用SYBR green 实时定量PCR方法，反应体系为25 μL，置于ABI PRISM 7500荧光定量PCR 仪中进行PCR 扩增，反应条件为95 ℃，10 min；随后以95 ℃，15 s 和60 ℃，1 min循环40次。 采用参照基因的 Ct 法计算目的基因mRNA 的相对表达量，采用相对定量法计算各基因mRNA 表达水平。

1.4统计学方法 使用SPSS 13.0软件进行统计学分析。临床病理类型采用Fisher精确概率法检验，生存曲线使用Kaplan-Meier 法进行绘制，两组间比较用t检验；Cox危险因素模型用多因素方差分析法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1炎症小体NLRP3在鼻咽癌组织中表达升高免疫组化显示NLRP3主要表达于细胞质内，偶见于细胞核(图1A、B)。NLRP3在鼻咽癌组织中阳性表达明显高于正常鼻咽黏膜组织(升高近6倍)，差异有统计学意义(P<0.01)。同样，实时定量PCR显示鼻咽癌组织中NLRP3表达量较正常组织升高近4倍，差异具有统计学意义(P<0.01)。

A：NLRP3在NPC和正常组织中的表达；上图为代表性免疫组化图片，下图为免疫组化阳性评分。B：实时定量PCR法检测鼻咽癌和正常鼻黏膜组织中NLRP3的表达(*P<0.05,n=7)。

图1NLRP3在鼻咽癌组织中的表达

2.2鼻咽癌组织中NLRP3的表达与预后的关系Kaplan-Meier生存曲线显示肿瘤组织中NLRP3高表达患者较低表达患者具有更好的局部无复发生存率(local recurrence-free survival,LRFS)和无瘤生存率(disease-free survival，DFS)，差异具有统计学意义(P<0.05，图2A、B)。

2.3鼻咽癌组织中NLRP3表达水平与各临床参数之间的关系鼻咽癌组织中NLRP3的表达水平与肿瘤临床病理类型、患者年龄无明显相关性，而和肿瘤的淋巴结转移有关(P<0.05，表2)。

表2鼻咽癌组织中NLRP3表达水平与各临床参数的关系

类别例数NLRP3表达水平高低P年龄/岁0.751 ≤45221012 >4518108组织类型1.000 基底样细胞鳞癌734 未角化癌331716淋巴结转移<0.001 有16142 无24618

A：Kaplan-Meier 生存曲线分析鼻咽癌患者肿瘤组织中炎症小体NLRP3的表达水平高低与患者LRFS之间的关系。 B：Kaplan-Meier生存曲线分析鼻咽癌患者肿瘤组织中炎症小体NLRP3的表达水平高低与患者DFS之间的关系。

图2鼻咽癌组织中NLRP3表达水平高低与LRFS和DFS的关系

3讨论

炎症是机体受到多种体内外因素刺激后产生的局部或全身性应答反应，也是机体针对肿瘤免疫应答和损伤修复的重要机制。许多研究表明，炎症细胞及其因子在肿瘤的发生发展和免疫逃逸等方面的促进作用远大于其本身的抗肿瘤效应，对炎症-肿瘤相互关系的研究是人类恶性肿瘤研究中十分重要的环节[8]。

炎症小体是一种细胞内大分子量的多蛋白复合体，由类型识别受体(如NLRP3、NLRC4、AIM2等)、接头蛋白ASC及caspase-1组成[9]，是天然免疫系统的重要组成部分。炎症小体能识别病原相关分子模式(PAMPs)[10]或者宿主来源的危险信号分子(DAMPs)[11]。炎性小体能够调节半胱天冬肽酶-1(caspase-1)的活化进而在天然免疫防御的过程中促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，发挥生物学效应[12-13]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)是最具代表性的炎症小体。NLRP3炎症小体在很多疾病中都发挥重要作用。Zhou等发现高浓度的葡萄糖能刺激胰岛细胞激活 NLRP3炎症小体,产生 IL-1β，引发炎症反应[14]。在肿瘤研究中，人们发现，NLRP3通过剪切糖皮质激素受体而诱导急性白血病(ALL)的糖皮质激素抵抗[15]。而在结肠癌[16]、胶质瘤[17]中，NLRP3炎症小体可抑制肿瘤的迁移及增值，表现出了组织差异性。

目前NLRP3在鼻咽癌中的角色尚不十分清楚。本研究通过对40例有临床随访资料的NPC患者进行分析，NLRP3在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织，表明NLRP3可能参与了NPC肿瘤的发生。我们知道，NPC治疗的最大障碍是肿瘤极易发生淋巴结转移，导致患者预后普遍较差。预防、预测并抑制NPC的转移对改善NPC患者的生存率无疑是非常关键的。而目前NLRP3与NPC淋巴结转移之间的关系却不清楚。本研究中，我们通过对NLRP3的表达与鼻咽癌患者临床各参数之间的统计学结果进行分析，发现淋巴结转移患者肿瘤组织中NLRP3的表达显著低于无转移的患者。同时我们也发现鼻咽癌组织中炎症小体蛋白NLRP3表达水平高低与患者的LRSF和DSF具有明显的相关性，NLRP3越高，LRSF和DSF越好，提示NLRP3参与了肿瘤的进展过程，在局部肿瘤组织中过表达炎症小体NLRP3可能起到控制肿瘤的作用。但NLRP3的水平高低却与患者年龄和肿瘤的病理类型无明显相关性。综上所述，本研究发现了NLRP3可能在NPC肿瘤的进展中发挥重要作用，可作为独立的良好预后分子标志物，为肿瘤提供有效的治疗靶点。

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文章编号：1002-0217(2016)04-0374-04

收稿日期：2015-11-22

作者简介：汤俊照(1981-)，男，住院医师，(电话)18956308352，(电子信箱)285127072@qq.com;

【文献标识码】【中图号】R 739.63A

NLRP3 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

TANG Junzhao,WANG Yipin

Department of ENT,Xuancheng Central Hospital,Xuancheng 242000,China

【Abstract】Objective：To determine the expression level change of inflammasome NLRP3 in tissues of nasopharyngeal carcinoma(NPC) and normal nasopharyngeal mucosa,and investigate the level change with clinical prognosis.Methods:Real-time quantitative PCR and immunohistochemistry techinqe were used to detect NLRP3 expression level in 40 patients with NPC and in 12 subjects with normal nasopharyngeal mucosa.Results:①The NLRP3 expression was significantly higher in NPC tissue than that in normal nasopharyngeal mucosa(P<0.05);②Expression level of NLRP3 was correlated with lymph node metastasis of the tumor and clinical prognosis in patients with nasopharyngeal cancer(P<0.05).Although patients with higher NLRP3 expression level had better local recurrence-free survival (LRFS) and disease-free survival (DFS),yet NLRP3 level had no obvious correlation with patients′ age and histopathologic types of tumor (P<0.05).Conclusion:Inflammasome NLRP3 is better indicative of tumor metastasis and prognosis for patients of NPC,and higher NLRP3 level may lead to better prognosis.

【Key words】NLRP3;neoplasm metastasis;nasopharyngeal carcinoma;LRSF/DSF

汪亦品，女，实验师，(电子信箱)yipin698@163.com，通信作者.