血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染时对T淋巴细胞数量和Toll样受体的影响

林泽辉， 陈国宁， 杜永明



血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染时对T淋巴细胞数量和Toll样受体的影响

林泽辉， 陈国宁， 杜永明

摘要：目的 观察血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染时对T淋巴细胞数量和Toll样受体（TLR）的作用。 方法 选取2013年1月—2014年12月重症腹腔感染患者78例，随机分为对照组和观察组（每组39例），两组患者均接受常规基础治疗，观察组患者在常规治疗基础上静脉滴注血必净注射液，50 mL/次，2次/d，连用2周。治疗前及治疗2周时抽取患者静脉血采用流式细胞术测定T淋巴细胞水平，分离外周血单个核细胞（PBMC）并采用荧光实时PCR测定TLR2和TLR4表达水平，记录两组患者入院时及治疗2周时的急性生理与慢性健康评分（APACHEⅡ评分）和胃肠功能评分。结果 治疗2周时，观察组患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均较对照组患者显著升高（P＜0.01），而CD8+水平较对照组患者显著降低（P＜0.01）；观察组患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均较对照组患者显著降低（P＜0.01）；观察组患者APACHE Ⅱ评分和胃肠功能评分均较对照组患者显著降低（P＜0.01）。结论 血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染时可改善患者的T淋巴细胞数量及降低外周血PBMC上TLR的表达。

关键词：血必净注射液； 重症腹腔感染； T淋巴细胞； Toll样受体

腹腔感染是指各种病原菌引起的腹腔内感染，通常为肠杆菌科细菌、肠球菌属和拟杆菌属等混合感染，是外科最常见的感染性疾病之一。重症腹腔感染是指合并脓毒症与脓毒症休克的腹腔感染，是外科ICU常见的危重症和主要死亡原因之一［1-2］。脓毒症主要以器官功能损害为特征，是影响ICU患者生存的最大威胁，是引起危重患者晚期死亡的首要原因［3］。虽然近年来抗感染治疗及器官功能支持技术也不断进步，但是脓毒症的临床预后仍然较差。重症腹腔感染患者普遍存在免疫紊乱，而免疫调节可以逆转重症感染后期的免疫抑制状态以及改善预后。Toll样受体（Toll like receptor，TLR）可启动特异性病原免疫应答反应以及细胞特异性免疫应答反应而发挥抗感染作用［4］。本研究观察血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染时对患者T淋巴细胞数量以及TLR2和TLR4的影响。

1　材料与方法

1.1临床资料

选取2013年1月—2014年12月本院ICU收治重症腹腔感染患者78例，其中男43例（55.1%），女35例（44.9%），年龄48～78岁平均65岁。所有患者入院时有腹痛、腹胀症状和全腹膜炎体征，并且腹腔引流液或穿刺液经细菌学检查证实感染的存在，经诊断消化道穿孔29例（37.2%）、急性化脓性阑尾炎穿孔21例（26.9%）、重症急性胰腺炎18例（23.1%），以及其他10例（12.8%，包括急性梗阻性化脓性胆管炎6例，肠系膜动脉栓塞4例）。患者纳入标准如下：①年龄＞18周岁；②具有腹膜刺激征，发热，血白细胞计数升高，并且符合脓毒症诊断标准［5］；③急性生理和慢性健康评分Ⅱ（APACHE Ⅱ评分）≥8分；④预计生存时间＞2周。本研究开展前得到医院伦理委员会批准，所有纳入患者或家属均签署知情同意书。患者依照随机数字表按1∶1分为观察组和对照组，每组39例。两组患者的年龄、性别、病因、感染持续时间、APACHE Ⅱ评分等临床资料具有可比性（P＞0.05），见表1。

表1　两组患者临床资料比较Table 1 Clinical data of the patients in both groups

1.2方法

两组患者常规给予抗感染、液体复苏、预防应激性溃疡、控制血糖、器官支持、肠外营养等，同时尽可能寻找腹部感染灶并行积极的冲洗引流措施。治疗中及时根据腹腔脓液细菌培养结果和药物敏感试验结果调整抗生素使用。观察组患者在常规治疗上静脉滴注血必净注射液，50 mL/次，2次/d，连用2周。治疗前及治疗2周时抽取患者静脉血采用流式细胞术测定T淋巴细胞水平，分离外周血单个核细胞（PBMC），采用荧光实时PCR测定TLR2和TLR4表达水平。记录两组患者入院时及治疗2周时的APACHEⅡ评分和胃肠功能评分［6］。胃肠功能评分标准如下：禁食、胃肠减压、肠鸣音减弱各为1分；反流、胃潴留、腹胀、腹痛、腹泻、肠鸣音消失、便秘各2分。

1.2.1 T淋巴细胞的测定 抽取外周静脉血5 mL 于EDTA抗凝管内，应用B.D.TEST（美国BD公司）直接免疫荧光标记全血细胞，CD3+、CD4+和CD8+单克隆抗体分别采用异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）标记和多甲藻（黄）素叶绿素蛋白复合物（PerCP）进行标记后，加入FACS Lysing（美国BD公司）溶解红细胞后应用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）检测淋巴细胞及其亚群，采用CELLQUEST SET 软件（美国BD公司）进行T细胞亚群的分析。

1.2.2 TLR2和TLR4测定 抽取外周静脉血5 mL，采用Ficoll-hypzue淋巴细胞分离液（上海华精高科技有限公司）分离得PBMC，用Trizol试剂（美国Invotrigen公司）提取PBMC内总RNA，取2 μg RNA加5 μL DEPC水，70℃水浴5 min，立即置于冰中进行反转录。TLR2和TLR4上游引物分别为5’-GAA GAA TCC TCC AAT CAG GCT TC-3’、 5’-AGG ATG ATG CCA CCA TGA TGG TC-3’，其下游引物分别为5’-GCC CTG AGG GGA ATG GAC TTT-3’、 5’-TCA GGT CCA GGT FCT FGG GTG AG-3’，产物长度分别为657 bp和550 bp。GAPDH为内参，上游引物为5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游引物为5’-TTG GTG AAG ACG CCA GTG GA-3’，产物长度为151 bp。反转录条件如下：42℃ 15 min，85℃5 min，4℃ 5 min。实时荧光定量PCR测定PBMC 中TLR2和TLR4的水平，PCR反应体系：ddH2O 13.8 μL，2×SYBR Mix 8.4 μL，上下游引物各0.35 μL，Taq酶0.1 μL，标本cDNA模板2 μL。扩增条件为：94℃ 2 min；94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算TLR2和TLR4 mRNA的表达量。

1.2.3 临床评价 记录两组患者入院时及治疗2周时的病情（APACHEⅡ评分、胃肠功能评分）。1.2.4 统计学处理 数据处理采用SPSS 18.0。计量数据组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验；计数资料组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组患者T淋巴细胞的比较

治疗前两组患者外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗2周时两组患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/ CD8+水平较治疗前显著升高（P＜0.01），CD8+水平较治疗前显著降低（P＜0.01），并且组间差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2　两组患者治疗前及治疗2周时T淋巴细胞水平的比较Table 2 Number of T lymphocytes before and after 2-week Xuebijing treatment in both groups

2.2两组患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA的比较

治疗前两组患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗2周时两组患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均较治疗前显著降低（P＜0.01），组间差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

2.3两组患者治疗前及治疗2周时的病情比较

治疗前两组患者APACHE Ⅱ评分和胃肠功能评分差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗2周时两组患者APACHE Ⅱ评分和胃肠功能评分均较治疗前显著降低（P＜0.01），组间差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。

表3　两组患者治疗前及治疗2周时外周血PBMC TLR2 和TLR4 mRNA的比较Table 3 Levels of TLR2 and TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of before and after 2-week Xuebijing treatment compared between groups

表4　两组患者治疗前及治疗2周时病情的比较Table 4 Disease status of the patients before and after 2-week Xuebijing treatment compared between groups

3　讨论

重症腹腔感染以需氧菌和厌氧菌的混合感染为主，患者病情危重，常继发下呼吸道、血液等部位的医院获得性感染。重症腹腔感染伴随着内皮细胞、血小板、白细胞和凝血纤溶系统以及多种炎性因子的相互作用，易继发多器官功能衰竭，最终因多器官功能障碍综合征导致治疗失败［7-8］。血必净注射液是由天津红日药业股份有限公司生产的中药复方注射剂，由红花、川芎、丹参、当归等组成，可化瘀解毒，用于温热类疾病，症见发热、喘促、心悸、烦躁等瘀毒互结证。现代药理研究证实，血必净注射液具有减少自由基、改善微循环、保护内皮细胞等功能［9-10］。此外，血必净注射液具有拮抗炎性反应递质以及内毒素的功效，能有效提高超氧化物歧化酶以及减少纤维蛋白的功效，同时对免疫系统具有双向调节功能［11-12］。目前临床上关于血必净注射液用于治疗重症腹腔感染相关研究相对有限。本研究显示，治疗2周时观察组患者APACHE II评分和胃肠功能评分均较对照组患者降低（P＜0.01），研究结果显示血必净注射液辅助治疗可显著改善重症腹腔感染患者的病情。

近年来，人们注意到免疫功能紊乱是导致重症感染发展并发多器官功能障碍的重要原因。T淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，正常机体内T淋巴细胞及各亚群相对稳定。T细胞的比值和绝对数发生改变被认为是免疫功能紊乱，CD4+/CD8+比值常作为一种评价免疫功能的临床指标［13］。有研究表明，提高脓毒血症患者CD4+T淋巴细胞水平及CD4+/CD8+比值可以提高患者的生存率［14］。本研究结果显示，治疗2周时观察组患者外周血CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平均较对照组患者显著升高（P＜0.01），而CD8+水平较对照组患者显著降低（P＜0.01），因此血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染患者可显著改善患者机体的免疫紊乱状态。机体发生感染后，局部的炎性反应对细菌/毒素的清除以及组织的修复具有重要作用，但是炎性反应过度活化可导致正常机体组织损伤。在脓毒症的发生发展过程中始终存在着炎性反应亢进，而过度全身炎性反应也能诱发多种免疫细胞凋亡。TLR是一类表达于细胞膜或膜内的模式识别受体，其主要功能是诱发炎性反应、诱导树突细胞的成熟和激活Th1或Th17细胞，发挥抗感染作用［15］。TLR持续激发的炎性反应或破坏体内稳态平衡，引起自身免疫性疾病、慢性炎症等［16］。TLR既可作为病原模式识别受体又可作为危险模式识别受体在不同程度损伤中起到始动作用［17］。有研究显示，全身炎性反应综合征、肝脏移植术后患者体内TLR 2和TLR 4表达上调，并认为TLR 2和TLR 4的上调有助于全身炎性反应综合征发生［18］。TLR 2和TLR 4通过激动NF-κB 促进各种细胞因子及炎症介质基因的转录合成，促进其表达各种损伤介质，打开下游的损伤过程［19］。因此，阻断TLR可能下调重症感染的炎性反应。TIDSWELL等［20］使用TLR4拮抗剂治疗重症感染，发现TLR4拮抗剂有降低病死率的趋势。本研究结果显示，治疗2周时观察组患者外周血PBMC TLR2和TLR4 mRNA水平均较对照组患者显著降低（P＜0.01），因此血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染患者可显著降低机体外周血PBMC TLR2和TLR4 的表达。血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染可改善患者T淋巴细胞数量及降低外周血TLR表达，这是其发挥临床治疗作用的原因。

总之，血必净注射液辅助治疗重症腹腔感染可改善患者的T淋巴细胞数量及降低外周血TLR表达。

参考文献：

［1］刘宏斌，李洪涛，苏琳，等. 腹腔开放疗法治疗严重腹腔感染的临床疗效［J］. 中华消化外科杂志，2014，13（7）：565-566.

［2］殷娜，邓小明. 外科重症监护病房腹腔感染相关脓毒症病原菌分布及耐药性分析［J］. 重庆医学，2014，43（7）：812-815.

［3］CHARLOTTE S. Reform. PCT chiefs fght loss of accountability status and right to redundancy ［J］. Health Serv J， 2011，121（6243）： 4-5.

［4］KAWAI T， AAIRA S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity： update on Toll-like receptors［J］. Nat Immunol，2010， 11（5）： 373-384.

［5］BONE RC， BALK RA， CERRA FB， et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine［J］. Chest， 1992， 101（6）： 1644 -1655.

［6］王今达，王宝恩. 多脏器功能失常综合征（MODS）病情分期诊断及严重程度评分标准（经庐山'95全国危重病急救医学学术会讨论通过）［J］.中国危重病急救医学，1995，7（6）：346-347.

［7］何清，叶华，钟贵芳，等. 替加环素治疗严重腹腔感染的疗效观察［J］. 中华医院感染学杂志，2014，24（9）：2158-2159.

［8］杨帆，赵允召，陈钰，等. 连续静脉-静脉血液滤过对严重腹腔感染血浆内毒素及细胞因子清除能力研究［J］. 中国实用外科杂志，2014，34（5）：444-446.

［9］邵敏，刘宝，王锦权，等. 脓毒症患者辅助性T细胞17和CD4+CD25+调节性T细胞表达及血必净注射液的干预作用［J］. 中国危重病急救医学，2011，23（7）：430-434.

［10］郑瑞强，陈齐红，林华，等. 血必净注射液对急性呼吸窘迫综合征患者免疫及预后影响的多中心随机对照临床研究［J］.中国中西医结合急救杂志，2012，19（1）：21-23.

［11］CARNOVALE A， RABITTI PG， MANES G， et al. Mortality in acute pancreatitis： is it all early or a late event［J］. JOP， 2005，6（5）： 438-439.

［12］张军，张宏峰，薛宏斌，等. 血必净注射液对重度烧伤患儿早期各器官功能的保护及拮抗应激作用研究［J］.中国全科医学，2014，17（11）：1266-1270.

［13］张敏，杨丽莎，彭德珍，等. 慢性HBV感染不同免疫状态及乙肝肝硬化外周血T、B细胞亚群和NK细胞的变化及意义［J］. 实用医学杂志，2014，30（20）：3233-3236.

［14］MCDUNN JE， TURNBULL IR， POLPITIYA AD， et al. Splenic CD4+ T cells have a distinct transcriptional response six hours after the onset of sepsis［J］. J Am Coll Surg， 2006， 203（3）：365-375.

［15］ O'REILLY S. Innate immunity in systemic sclerosis pathogenesis［J］. Clin Sci（Lond）， 2014， 126（5）： 329-337.

［16］CURTALE G， MIROLO M， RENZI TA， et al. Negative regulation of Toll-like receptor 4 signaling by IL-10 dependent microRNA-146b［J］. Proc Nat Acad Sci U S A， 2013， 110（28）：11499-11504.

［17］JUSKEWITCH JE， KNUDSEN BE， PLATT JL， et al. LPS-induced murine systemic infammation is driven by parenchymal cell activation and exclusively predicted by early MCP=1 plasma levels ［J］. Am J Pathol，2012，180（1）： 32-40.

［18］HEI Z， CHI X， CHENG N， et al. Upregulation of TLR2/4 expression in mononuclear cells in postoperative systemic infammatory response syndrome after liver transplantation ［J］. Mediat Infammat， 2010， 201（1）： 12-19.

［19］CHENG X， GAO D， CHEN B， et al. Endotoxin-binding peptides derived from casein glycomacropeptide inhibit lipopolysaccharide-stimulated inflammatory responses via the blockade of the NF-κB activation in macrophages［J］. J Nutrients，2015， 7（5）： 3119-3137.

［20］TIDSWELL M， TILLIS W， LAROSA SP， et al. Phase 2 trial of tetrasodium （E5564）， a toll-like receptor 4 antagonist，in patients with severe sepsis［J］. Crit Care Med， 2010， 38（1）： 72-83.

中图分类号：R378.1

文献标识码：A

文章编号：1009-7708（2016）03-0257-05

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.004

收稿日期：2015-06-01 修回日期：2015-12-21

作者单位：海南省中医院急诊科，海口，570203。

作者简介：林泽辉（1980—）男，本科，主治医师，主要从事急诊医学研究。

通信作者：杜永明，E-mail：29015463@qq.com。

Effect of Xuebijing injection on the number of T lymphocytes and Toll-like receptors as adjuvant therapy of severe abdominal infections

LIN Zehui， CHEN Guoning， DU Yongming. （Department of Emergency Medicine， Hainan Provincial Hospital
of Traditional Chinese Medicine， Haikou 570203， China）

Abstract:Objective To examine the effect of Xuebijing Injection on the number of T lymphocytes and Toll-like receptors as adjuvant therapy of severe abdominal infections. Methods A total of 78 patients with severe abdominal infection who were hospitalized in the intensive care unit were divided into control group and treatment group. The patients in control group received conventional therapy alone， while the patients in treatment group received Xuebijing Injection （50 mL twice daily for 2 weeks）in addition to conventional therapy. Blood sample was drawn before and after 2-week treatment to determine T lymphocytes. The peripheral blood mononuclear cells were separated to determine the expression of Toll-like receptors （TLR） 2 and TLR4. The Acute Physiology and Chronic Health Evaluation （APACHE） II score and gastrointestinal function score were recorded before and after treatment. Results The levels of CD3+， CD4+and CD4+/CD8+of peripheral blood in the Xuebijing-treated patients were signifcantly higher than those in control group （P＜0.01）， but the levels of CD8+was signifcantly lower than that in control group （P＜0.01）. The levels of TLR2 and TLR4 mRNA of the peripheral blood mononuclear cells in the treatment group were signifcantly lower than those in control group （P＜0.01）. The APACHE II score and gastrointestinal function score in treatment group were signifcantly lower than those in control group （P＜0.01）. Conclusion Xuebijing Injection as adjuvant therapy of severe abdominal infection can improve the number of T lymphocytes， and reduce the expression of Toll-like receptors.

Key words:Xuebijing injection； severe abdominal infection； T lymphocyte； Toll-like receptor