植物多酚氧化酶对多环芳烃污染的体外诱导响应

杨振亚，卢晓丹，高彦征①

(1.江苏省环境科学研究院/ 江苏省环境工程重点实验室，江苏 南京　210036；2.南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所，江苏 南京　210095)



植物多酚氧化酶对多环芳烃污染的体外诱导响应

杨振亚1,2，卢晓丹2，高彦征2①

(1.江苏省环境科学研究院/ 江苏省环境工程重点实验室，江苏 南京210036；2.南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所，江苏 南京210095)

摘要：文献中多采用生物体内实验方法来研究污染物对植物酶的诱导作用，但体内实验操作相对繁琐，耗时长，亟需采用一种快速、简便的体外实验方法来研究多环芳烃(PAHs)等对植物酶的影响。采用植物体外实验方法，以三叶草(Trifolium repens)为供试植物，研究了三叶草茎叶中多酚氧化酶(PPO)对二环PAHs苊和四环PAHs芘的体外诱导响应。结果表明，ρ(苊)为0～39.68 mg·L-1时，三叶草茎叶PPO活性随苊污染浓度增大而升高，表现为诱导效应；ρ(芘)为0～0.16 mg·L-1时，PPO活性随芘污染浓度增大呈先升高后降低趋势，表现为先诱导后抑制效应。三叶草茎叶PPO对苊和芘的体外污染的敏感性响应顺序为苊<<芘，与其自身毒性顺序一致。采用体外实验方法可快速、有效、简单地评价PAHs对植物PPO的诱导效应。

关键词：植物；多酚氧化酶；多环芳烃；体外诱导

多环芳烃(PAHs)是污染土壤中常见的一类高风险有机污染物,具有“三致”效应，对生物体亲和力强。国际癌症研究中心(IARC)列出的94种对实验动物致癌的化合物中,15种为PAHs。2014年4月,环境保护部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》中指出,我国土壤中PAHs点位超标率达1.4%。土壤污染后,PAHs可通过多种途径进入植物体内,影响农产品质量,并可通过食物链危害人类健康。研究PAHs胁迫下植物体内酶响应及代谢行为对于评价土壤污染风险、减低植物PAHs污染风险、保障农产品安全等有重要意义[1]。

生物代谢中酶活性的变化是一种能反映环境物理和化学变化的生物标记物,它可以对环境的变化提供早期预报。因此,越来越多的学者关注植株体内酶在逆境中的变化,试图用酶的变化来诊断环境污染状况[2]。关于重金属对植物酶影响的研究已较深入[3-4],一些学者研究了病菌[5-6]以及农药[7]等对植物酶活性的影响,但有关PAHs类有机污染物对植物酶影响的报道却鲜见。另一方面,多酚氧化酶(PPO)能作用于PAHs等有机污染物,将其转化为易于降解的物质从而加速其降解,减轻污染毒性[8]。PPO作为PAHs降解途径中一类关键酶,能催化PAHs开环,生成较易降解的中间产物,在PAHs降解过程中起着关键作用[1],搞清PAHs对PPO的诱导作用有助于进一步揭示植物代谢PAHs的机理。

从已有的文献来看,有关PAHs对酶的诱导研究所采用的传统实验方法多为生物体内实验[2,8-9]，但体内实验操作相对繁琐，耗时长。因此,亟需建立一种快速、简便的体外实验方法来研究PAHs等有机污染物对植物酶的影响。笔者以苊和芘作为PAHs代表物,以三叶草(Trifoliumrepens)为供试植物,通过体外实验方法研究PAHs对三叶草PPO的诱导效应。

1材料与方法

1.1试剂

苊、芘购自北京化学试剂公司,纯度w>98%;二甲基亚砜(DMSO)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二酚、配制pH值为7.8的磷酸缓冲溶液以及营养液用的各种试剂均为分析纯。

1.2实验方法

供试植物为三叶草,根据Hoagland营养液配方[6]于温室中采用砂培方式进行培养。三叶草种子经去离子水浸泡后,直接播种于盛有石英砂的底部有孔的花盆中,遮光催芽,将花盆浸于盛有营养液的周转箱中,保持液面高度为石英砂高度的2/3。温室中白天温度为25～35 ℃,夜间为15～25 ℃,自然光照。待株高20 cm左右收获植物,植物样品经蒸馏水充分淋洗后,用滤纸吸干表面水分,于-65 ℃条件下保存待用。

PPO的提取参考卢晓丹等[8]的方法:准确称取三叶草茎叶0.200 g,加0.1 g PVP、0.2 g石英砂和16 mL预冷的pH值为6.0的磷酸缓冲液(PBS),冰浴研磨,10 000 r·min-1冷冻离心(离心半径10 cm)15 min,取上清液为PPO提取液,保存于冰箱中待用,以上操作均在4 ℃条件下进行。

三叶草PPO的体外诱导实验参考王咏等[2]和吴伟等[10]的方法:将受试化合物苊和芘用DMSO溶解,配成一个浓度系列,每个浓度取50 μL,然后和100 μL上述酶液、2 000 μL pH值为6.0的 PBS缓冲液、1 000 μL 0.1 mol·L-1邻苯二酚在试管中混匀,并在25 ℃条件下保温5 min,用分光光度计比色法测定酶活性。对照为50 μL DMSO 溶液,每个处理做3个平行。

1.3分析方法

采用邻苯二酚比色法测定PPO活性[8]:依次向比色管中迅速加入2 mL 0.01 mol·L-1、pH 值为6.0的磷酸缓冲液、1.0 mL 0.1 mol·L-1邻苯二酚、0.2 mL酶液。反应介质摇匀,在420 nm波长下比色测定。酶液加入后开始计时,每20 s记录1次吸光度(D420),共记录5次。重复3次,酶活性以每分钟D420值每增加0.01为1个活力单位(△D420·min-1·mg-1)。

植物PPO活性的诱导率/抑制率(I)计算公式如下:

I=(E-E0)/E0×100%。

(1)

式(1)中,E为PAHs诱导下植物酶活性;E0为无污染对照植物酶活性。I为正值表示诱导率,I为负值表示抑制率。

参照卢晓丹等[8]的方法,计算PPO对苊和芘污染的敏感性指数(R),公式如下:

R=(E-E0)/Cw×100%。

(2)

式(2)中,R为酶敏感性响应指数,即单位浓度PAHs所导致的酶活性增量;E为污染条件下植物酶活性;E0为无污染对照的植物酶活性;Cw为PAHs质量浓度,mg·L-1。

2结果与讨论

2.1苊和芘对三叶草PPO活性的影响

图1为体外诱导实验中苊对三叶草茎叶中PPO活性的影响。

图1　不同浓度苊对三叶草茎叶PPO活性的影响

供试苊浓度范围内,随苊污染浓度增加PPO活性总体上呈增加趋势。无苊污染时,三叶草茎叶中PPO活性为4 092.54 △D420·min-1·mg-1;ρ(苊)为39.68 mg·L-1时PPO活性则增大到6 842.62 △D420·min-1·mg-1,比对照增加67.20%。ρ(苊)<20 mg·L-1时,苊对三叶草茎叶中PPO活性的影响不显著,但当ρ(苊)>25 mg·L-1时,随苊污染浓度增加PPO活性快速增加。

芘对三叶草茎叶PPO活性的影响见图2。ρ(芘)为0～0.159 mg·L-1时,三叶草茎叶中PPO活性随芘污染浓度升高呈先升高后降低趋势。低浓度(0.119 mg·L-1)下芘促进了茎叶中PPO活性提高,其中ρ(芘)为0.04 mg·L-1时茎叶中PPO活性最高(4 431.90 △D420·min-1·mg-1),比对照提高56.41%。但当ρ(芘)>0.143 mg·L-1时则抑制三叶草茎叶PPO活性。有研究表明壬基酚对鱼肝EROD的体外诱导表现出同样趋势[10]。

图2　不同浓度芘对三叶草茎叶PPO活性的影响

有学者采用体外诱导实验方法研究了PAHs对动物体内酶活性的影响,得出相似规律。王咏等[2]研究了苯并[a]芘、菲、1-羟基芘、芘和9,10-萘醌对鲤鱼肝微粒体EROD酶系的体外诱导,结果表明毒性较小的菲和1-羟基芘处理主要表现为诱导酶活性升高,而毒性最强的苯并[a]芘则表现为先诱导酶活性升高,当苯并[a]芘浓度继续升高时EROD活性下降,笔者的研究结果与之一致。

也有学者采用植物体内实验方法,研究了不同PAHs对植物体内几种酶活性的影响。卢晓丹等[8]研究发现,随着二环PAHs的ρ(萘)从0升至35 mg·L-1,黑麦草(Loliummultiflorum)根和茎叶中PPO呈增大趋势;而随着四环PAHs的ρ(芘)从0升至0.15 mg·L-1,黑麦草根和茎叶中PPO呈先升高后降低趋势。这些结果与体外诱导实验中二环苊和四环芘影响植物茎叶中PPO活性的规律具有很好的一致性,表明体外实验方法可快速、有效、简单地研究和评价PAHs对植物PPO的诱导效应。

2.2苊和芘对三叶草茎叶中PPO活性的体外诱导率或抑制率

由表1可以看出,苊胁迫下对PPO主要表现为诱导效应,且诱导率随胁迫增加而增大;而芘胁迫下PPO活性表现为先诱导后抑制趋势,其中,当ρ(芘)<0.119 mg·L-1时,主要表现为诱导效应,大于该浓度时主要表现为抑制作用,当ρ(芘)最大(0.159 mg·L-1)时,抑制作用最明显,这与卢晓丹等[8]开展的体内实验中菲对黑麦草PPO的影响结果较一致。另外,阮长青等[11]研究了有机磷农药对小麦酯酶的体外抑制作用,并绘制了抑制曲线,其中辛硫磷、敌敌畏等10种有机磷农药均对小麦酯酶有抑制作用,且抑制曲线存在明显的单调递减区间,即随农药浓度增大抑制作用增强,这一规律与上述结果相似。

表1不同浓度下苊和芘对三叶草茎叶PPO活性的诱导率或抑制率

Table 1PPO activity induction and inhibition rates of acenaphthene and pyrene in clover shoots relative to concentration of the pollutant

苊芘ρ/(mg·L-1)诱导率或抑制率/%ρ/(mg·L-1)诱导率或抑制率/%3.21.30.8×10-2-0.56.34.51.3×10-20.59.55.11.9×10-2-1.012.70.64.0×10-25.615.92.56.3×10-23.119.0-1.99.5×10-22.625.421.711.9×10-20.531.713.414.3×10-2-1.539.767.215.9×10-2-2.0

正值表示诱导率，负值表示抑制率。

在研究PAHs、重金属等外源化合物对酶的体内、体外诱导中,低浓度处理诱导酶活性上升、高浓度处理酶活性下降的现象很普遍。有些观点认为,这是由于高浓度外源化合物对细胞整体功能的负面影响而造成酶活性降低;也有学者认为,这是由于外源化合物对酶本身的毒害作用导致酶活性降低[2,8],而产生这一现象的机制还有待于进一步研究。

2.3PPO对苊和芘污染的敏感性

参照卢晓丹等[8]的方法,计算了PPO对苊和芘污染的敏感性指数,比较了三叶草茎叶PPO对供试PAHs的响应差异。酶活性对2种PAHs的敏感性指数大小为苊(0.005 5)<<芘(0.45),PPO对苊的敏感性响应指数比对芘的小2个数量级,这与PAHs本身性质有关。苊为二环PAHs,而芘为四环PAHs,毒理学试验表明,PAHs毒性一般随苯环数增加而递增,因此植物酶对其敏感程度也随之增大。

3结论

(1)三叶草茎叶PPO对PAHs污染的体外诱导实验发现,ρ(苊)为0～39.68 mg·L-1时,随苊污染浓度增大三叶草茎叶PPO活性升高,表现为诱导效应;ρ(芘)为0～0.16 mg·L-1时,PPO活性随芘污染浓度增大先升高后降低,表现为先诱导后抑制效应。

(2)三叶草茎叶PPO对苊和芘体外污染的敏感性响应顺序为苊<<芘,与其自身毒性顺序一致。

(3)体外实验方法可快速、有效、简单地研究和评价PAHs对植物PPO的诱导效应。

参考文献：

[1]LING W T,LU X D,GAO Y Z,etal.Polyphenol Oxidase Activity in Subcellular Fractions of Tall Fescue (FestucaarundinaceaSchreb.) Contaminated by Polycyclic Aromatic Hydrocarbons[J].Journal of Environmental Quality,2012,41(3):807-813.

[2]王咏,王春霞,徐静波.多环芳烃化合物对鲤鱼肝微粒体EROD的体外诱导[J].环境科学学报,2000,20(增刊1):176-180.

[3]严重玲,洪业汤,付舜珍,等.Cd、Pb胁迫对烟草叶片中活性氧清除系统的影响[J].生态学报,1997,17(5):488-492.

[4]杨兵,廖斌,邓冬梅,等.Cu2+对两种生态型鸭跖草Cu积累和抗氧化酶的影响[J].中国环境科学,2004,24(1):9-13.

[5]郭红莲,程根武,陈捷,等.玉米灰斑病抗性反应中酚类物质代谢作用的研究[J].植物病理学报,2003,33(4):342-346.

[6]高增贵,陈捷,刘军华,等.拮抗内生细菌B20-2006菌株对玉米主要防御酶系的影响[J].植物病理学报,2007,37(1):102-104.

[7]唐光辉,田鹏鹏,陈安良,等.两种农药树干注射对垂柳叶内PPO和POD活性及同工酶谱的影响[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(4):145-149.

[8]卢晓丹,高彦征,凌婉婷,等.多环芳烃对黑麦草体内过氧化物酶和多酚氧化酶的影响[J].农业环境科学学报,2008,27(5):1969-1973.

[9]王静,潘鲁清,苗晶晶.多环芳烃化合物对栉孔扇贝组织芳烃羟化酶活力的影响[J].海洋科学，2007,31(12):19-23.

[10]吴伟,吴滟,陈家长,等.壬基酚聚氧乙烯醚及壬基酚对鱼肝EROD酶的体外诱导[J].中国环境科学,2005,25(增刊1):125-128.

[11]阮长青,杨娟,贾伟.有机磷农药与小麦酯酶的作用关系研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2006,18(1):61-62.

(责任编辑： 陈昕)

收稿日期：2015-11-03

基金项目：农业部公益性行业(农业)科研专项(201503107)；江苏省杰出青年基金(BK20130030)

通信作者①E-mail: gaoyanzheng@njau.edu.cn

中图分类号：X83

文献标志码：A

文章编号：1673-4831(2016)04-0687-04

DOI：10.11934/j.issn.1673-4831.2016.04.027

作者简介：杨振亚(1981—),男,江苏金湖人,工程师,硕士,主要研究方向为环境污染评价与控制。E-mail: 0517jhyzy@163.com

Response of Phenol Oxidase in Plant to in Vitro Induction of Contaminant of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons.

YANG Zhen-ya1,2, LU Xiao-dan2, GAO Yan-zheng2

(1.Jiangsu Key Laboratory of Environmental Engineering, Jiangsu Provincial Academy of Environmental Science, Nanjing 210036, China;2.Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The knowledge of impacts of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) on enzyme activities in plant will be of great significance to risk assessment of PAH contamination. However, little information is hitherto available in literature on in vitro experiment to study PAH-influenced enzyme activity in plant. Impacts of PAHs on phenol oxidase (PPO) activity in shoots of clover (Trifolium repens) were investigated in vitro. Acenaphthene and pyrene were used to represent PAHs. PPO activity in clover shoots was enhanced steadily with rising acenaphthene concentration from 0 to 39.68 mg·L-1, indicating an inductive effect of acenaphthene on PPO activity. In contrast, PPO activity increased first and decreased thereafter with increasing pyrenecon centration from 0 to 0.16 mg·L-1, suggesting an inductive effect in the early phase and an inhibition effect in the late phase. It was observed that PPO in clover shoots was more sensitive to acenaphthene stress than to pyrene stress, which is consistent with the trend of acenaphthene being higher than pyrene in toxicity. All the results of this work indicate that in vitro experiment may be a fast, simple and effective means to evaluate impacts of PAHs on PPO activity in plants.

Key words:plant; phenol oxidase; polycyclic aromatic hydrocarbon; induction in vitro