4种自身抗原与狼疮性肾炎相关性的CrELISA分析

胡桑，谭杰文，乔玉莉，龚祖康，黄渝，廖维芳，周素芳，陈志坚，苏家光，林文珍1.广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，广西南宁，0021；2.广西高校生物分子医学研究重点实验室，广西南宁，0021；.南宁急救医疗中心，广西南宁，0001；.广西医科大学第一附属医院检验科，广西南宁，0021；广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，广西南宁，0021

论著

4种自身抗原与狼疮性肾炎相关性的CrELISA分析

胡桑1，2，谭杰文1，2，乔玉莉1，2，龚祖康3，黄渝1，2，廖维芳1，2，周素芳1，2，陈志坚4，苏家光5，林文珍1，2
1.广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，广西南宁，530021；2.广西高校生物分子医学研究重点实验室，广西南宁，530021；3.南宁急救医疗中心，广西南宁，530001；4.广西医科大学第一附属医院检验科，广西南宁，530021；5广西医科大学第一附属医院皮肤性病科，广西南宁，530021

目的分析4种自身抗原与狼疮性肾炎（LN）的相关性，以寻找具有更高敏感性与特异性的特征性自身抗原。方法收集广西医科大学第一附属医院检验科2013年7月—2014年7月期间的患者血清120例，其中正常人血清、系统性红斑狼疮（SLE）患者血清、LN患者血清及肾病综合征（NS）患者血清各30例。以CrELISA法检测四种阳性抗原蛋白在各组血清中的表达情况，并以生物信息学分析结果。结果 A1、A2在SLE组中的表达量（0.67±0.36）、（0.31±0.18）相对在正常人组中的表达量（0.47±0.24）、（0.22±0.10）与NS组中的表达量（0.33±0.17）、（0.19±0.10）更高（P＜0.05），与LN组中的表达量（0.53±0.27）、（0.27±0.14），差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 4种抗原中，A1、A2的敏感性相对较高，更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望成为SLE/LN的诊断依据。

狼疮性肾炎；系统性红斑狼疮；自身抗原；CrELISA法

［Abstract］Objective To assess the relevance of four autoantigens to lupus nephritis（LN），and find out some more sensitive and specific characteristic autoantigens.Methods Sera were acquired from Laboratory Department of the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University in July 2013 to July 2014，containing 30 normal sera，30 systemic lupus erythematosus（SLE）patients'sera，30 LN patients'sera and 30 nephrotic syndrome（NS）patients'sera.The normal group came from healthy examinees.The SLE group was collected according to SLICC Revision of the ACR Classification Criteria for SLE.The LN group came from those SLE patients with renal lesions.The NS group came from NS patients without SLE.Crude lysate enzyme-linked immunosorbent assay（CrELISA）was used to detect potential antigens'expression levels in each group.Bioinformatics method was used to analyze the results.Results Expression levels of A1 and A2 in SLE group（0.67±0.36），（0.31±0.18）are statistically higher than those in normal group（0.47±0.24），（0.22±0.10）and NS group（0.33±0.17），（0.19±0.10）（P＜0.05），but similar to those in LN group（0.53±0.27），（0.27±0.14）（P＞0.05）.Conclusion Among these four autoantigens，A1 and A2 suggest higher sensibility，which make them the more possible characteristic autoantigens of SLE/LN and hopeful diagnostic basis.

［Key words］lupus nephritis；Systemic lupus erythematosus；Autoantigen；Crude lysate ELISA

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，由于免疫功能紊乱使体内产生多种自身抗体，导致皮肤、粘膜、肌肉、血管等多系统、多器官损害。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE累及肾脏所引起的一种免疫复合物性肾炎，是SLE的主要合并症，也是引起SLE患者死亡的主要原因［1］。目前尚未有SLE/LN的治愈方法，只能依靠早诊断早治疗，以控制病情，延长患者寿命。

LN的临床表现复杂多变，易与其他类型肾病混淆，目前最准确的诊断方法肾穿刺活检因其创伤性及部分患者的身体原因而不易推广。在诊断的另一途径免疫学检查中，靶抗原为dsDNA，Sm，ANAC，C1q等的抗体作为常用检测指标［2-3］，对疾病在不同阶段的特异性或敏感性尚有不足［4-5］，因此更高效的特征性自身抗原还有待发掘。

前期课题组以SEREX技术筛选到与LN可能相关的自身抗原A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PR PF40A）、Q10（CIAO1），为了检测其特异性，本文以CrELISA法检测已筛选到的4种可能相关自身抗原，在广西医科大学第一附属医院检验科2013年7月—2014年7月期间收集的120例患者血清中的表达情况［6］，以分析抗原与疾病的相关性，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

导入了阳性抗原A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）的pBluescript质粒的大肠杆菌XLOLR来自广西医科大学生物化学与分子生物学教研室林文珍老师课题组。IPTG购自Merck公司，蛋白酶抑制剂购自AppliChem公司，HEPES和对硝基苯磷酸二钠购自Amresco公司，羊抗人IgG-AP购自Jackson公司，BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

血清样本是在2013年7月—2014年7月间从广西医科大学第一附属医院检验科收集，并获得广西医科大学伦理委员会批准并经患者同意及签署知情同意书。SLE组血清采集参照SLICC-SLE分类标准［7］，其中满足肾脏病变者的血清作为LN组。正常人组来自健康体检人群，肾病综合征 （nephrotic syndrome，NS）组来自未患SLE的NS患者。所得血清中SLE组有30例（男9例、女21例），年龄范围17～43岁，平均年龄（23.9±5.9）岁；LN组30例（男11例、女19例），年龄范围20～46岁，平均年龄（28.2±6.1）岁；正常人组30例（男15例、女15例），年龄范围25～40岁，平均年龄（31.4±5.1）岁；NS组30例（男18例、女12例），年龄范围21～60岁，平均年龄（33.5±10.3）岁。所有的样本贮存于-80℃冰箱中备用。

1.2方法

1.2.1蛋白诱导表达时间的确定 将导入了阳性抗原pBluescript质粒的大肠杆菌XLOLR以LB培养基培养至A600～0.35，加入2 mM的IPTG，37℃诱导表达6 h。分别取0、2、3、4、5、6 h培养液（其中0 h培养液中未含有IPTG，将之取出后继续振荡培养6 h），离心后细胞重悬于PBS（pH 7.2，含有0.2 mM蛋白酶抑制剂）并反复冻融5～6次，将蛋白裂解液进行SDS-PAGE，检测不同时间的蛋白表达量。

1.2.2包被抗原浓度的确定BCA法检测蛋白含量。蛋白裂解液以包被液（100 mM HEPES，pH 7.2）稀释至不同浓度 （5、10、20、40、80 μg/mL），50 μL/孔加至96孔板，37℃吸收2 h进行固定。漂洗后每孔加入50 μL血清（以含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶100稀释，空白对照为不加血清的稀释液），室温振荡孵育1 h。漂洗后每孔加入50 μL羊抗人IgG-AP（含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶5000稀释），室温孵育1 h。漂洗后每孔加入100 μL反应底物（以ALP缓冲液溶解的2 mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液），室温反应30 min后马上测A405值。

1.2.3 CrELISA方法检测狼疮性肾炎相关抗原A1 （TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）的特异性 将导入了阳性抗原pBluescript质粒的大肠杆菌XLOLR以LB培养基培养至A600～0.35，加入2 mM的IPTG，37℃诱导表达。培养液离心重悬于PBS（pH 7.2，含有0.2 mM蛋白酶抑制剂）中，反复冻融5～6次后离心取上清，BCA法测其蛋白含量。蛋白裂解液稀释于包被液 （100mM HEPES，pH 7.2），50 μL/孔加至96孔板，37℃吸收2 h进行固定。漂洗后每孔加入50 μL血清 （以含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶100稀释，空白对照为不加血清的稀释液），室温振荡孵育1 h。漂洗后每孔加入50 μL羊抗人IgG-AP（含3%奶粉的50 mM HEPES 1∶5000稀释），室温孵育1 h。漂洗后每孔加入100 μL反应底物（以ALP缓冲液溶解的2mg/mL对硝基苯磷酸二钠溶液），室温反应30 min后马上测A405值。

1.3统计方法

使用SPSS 16.0统计学软件进行该研究数据分析，计量数据用均数±标准差（±s）表示，运用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1蛋白诱导表达结果

目的抗原以IPTG诱导表达，取不同时间段菌体冻融裂解后蛋白，以SDS-PAGE检测目的蛋白（约为33KDa）诱导表达情况，可看出诱导4 h时表达量到达高峰（图1）。

图1　SDS-PAGE检测目标蛋白IPTG诱导表达情况（M为marker）

2.2不同抗原浓度包被的结果

蛋白裂解液稀释至不同浓度进行反应，由结果可以看出40 μg/mL时抗体结合达到饱和（表1）。

表1　不同抗原浓度对应A405值

2.3 CrELISA结果分析

t检验分析结果显示A1、A2在SLE组中的表达量相对在正常人与NS组中的表达量更高 （P＜0.05）。A1、A2、B2、Q10在LN组中的表达量相对在NS组中的表达量更高（P＜0.05），而与SLE组中的表达量基本差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2　t检验分析各抗原在不同血清中的表达情况（±s）

表2　t检验分析各抗原在不同血清中的表达情况（±s）

注:表达情况以A405值（Mean±SD）表示。*1与正常人组和NS组相比差异有统计学意义，P＜0.05。*2与NS组相比差异有统计学意义，P＜0.05。*3与正常人组相比差异有统计学意义，P＜0.05。

抗原编号　　正常人　SLE　LN　NS A1 A2 B2 Q10 0.47±0.24 0.22±0.10 0.28±0.11 0.26±0.13 （0.67±0.36）*1（0.31±0.18）*1（0.36±0.20）*2（0.32±0.19）*2（0.53±0.27）*2（0.27±0.14）*2（0.28±0.13）*2（0.28±015）e （0.33±0.17）*30.19±0.10 （0.17±0.09）e 0.20±0.10

3　讨论

CrELISA（crude lysate ELISA）是由德国的zlem Türeci等提出的一种快速评价多种抗原的高通量研究方法，目的是为SEREX技术筛选出来的大量抗原的鉴定工作节省时间，省去繁杂冗长的克隆、表达和纯化，提高鉴定效率。这一方法先通过原核表达系统表达出SEREX筛选所得的自身抗原并制成蛋白裂解液，再以抗原蛋白作为固相抗原、血清（或处理过的）作为抗体、酶标记抗人球蛋白作为二抗进行ELISA实验。相较于使用纯化抗原的标准ELISA法88%的特异性与100%的敏感性，CrELISA法的特异性为100%且敏感性达到了93%，已足够适用于基础实验的研究［8］。近年来，CrELISA法已被应用于肿瘤抗原的初步鉴定［9］。

在该研究中，对A1（TMEM158）、A2（unknown）、B2（PRPF40A）、Q10（CIAO1）进行CrELISA检测分析，发现A1、A2在SLE组中的表达量相对在正常人与NS组中的表达量更高（P＜0.05），与LN组中的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。说明4种抗原中，A1、A2的敏感性相对较高，更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望成为SLE/LN的诊断依据。A1（TMEM158）是一种跨膜蛋白，基因位于染色体3p21.3，其转录水平在Ras途径激活后上调。已有研究表明TMEM158 在I型、II型及妊娠期糖尿病患者体内表达有上调趋势［10］，但在SLE并LN中还是首次显示出相关性。A2（unknown）的基因序列经过比对没有找到相似的基因，可能在该文中首次发现。B2（PRPF40A）是一种前体mRNA加工因子，基因位于染色体2q23.3，据推测可能参与了细胞的分裂与迁移等。Q10（CIAO1）属于WD40家族，基因位于染色体2q11.2。有对酵母CIAO1蛋白的研究认为它能与肿瘤抑制蛋白WT1作用［11］，但在人体尚未发现其与疾病相关。四种抗原在SLE/LN的发生与发展中具体起着什么样的作用，尚有待于进一步的研究揭示。

综上所述，4种抗原中A1（TMEM158）、A2（unknown）更可能是SLE/LN的特征性自身抗原，有望用于SLE/LN的临床诊断、大范围人群血清学检测、判断复发及临床疗效检测等。此外，CrELISA法作为一种快速的高通量研究方法，可应用于更多疾病的抗原鉴定，加速疾病的研究进程，为了解疾病的生物学特征及发病机制等做贡献。

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Identification of Four Potential Lupus Nephritis-associated Autoantigens by CrELISA

HU Sang1，2；TAN Jie-wen1，2；QIAO Yu-li1，2；GONG Zu-kang3；HUANG Yu1，2；LIAO Wei-fang1，2；ZHOU Su-fang1，2；CHEN Zhi-jian4；SU Jia-guang5；LIN Wen-zhen1，2
1.Epartment of Biochemistry and Molecular Biology，School of Preclinical Medicine，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China；2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Biological Molecular Medicine Research，Nanning，Guangxi Province，530021 China；3.Nanning Emergency Medical Center，Nanning，Guangxi Province，530001 China；4.Laboratory Department，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China；5.Dermatology Department，the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi Province，530021 China

R593

A

2096-1782（2016）06-0001-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.001

本研究由国家自然科学基金项目（81160263）、广西自然科学基金项目（2010GXNSFA013162）。

胡桑（1990-），女，湖南桃江人，硕士，在读研究生，主要从事狼疮性肾炎相关胚胎抗原的筛选和鉴定工作。

林文珍（1972-），女，广东廉江人，博士，教授，主要从事肿瘤细胞与分子生物学研究，E-mail:linwenzhen@msn. com。

2016-02-28）