HPV感染宫颈组织中14-3-3σ表达及启动子甲基化水平检测

齐淑贞王少明张瑞丽周斌兵尤志学苏晓红王千秋



·论著·

HPV感染宫颈组织中14-3-3σ表达及启动子甲基化水平检测

齐淑贞1王少明2张瑞丽3周斌兵4尤志学4苏晓红1王千秋1

目的： 检测HPV感染宫颈组织中14-3-3σ启动子甲基化与14-3-3σ mRNA的表达。方法： 采用甲基化特异性PCR技术检测26例宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌，39例宫颈尖锐湿疣及35例对照标本中14-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化状态，Q-PCR法检测14-3-3σ mRNA表达，Western Blot检测14-3-3σ蛋白的表达。结果： 宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组中14-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化率为73.08%，明显高于对照组的22.86%，差异有统计学意义（P＜0.05）；尖锐湿疣组为17.94%与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组的14-3-3σ mRNA及蛋白表达较对照组减少，宫颈尖锐湿疣组14-3-3σ mRNA及蛋白表达较对照组增加。结论： HPV感染宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组织中14-3-3σ表达减少可能与14-3-3σ启动子高甲基化相关。

尖锐湿疣； 人乳头瘤病毒； 宫颈上皮内瘤变； 宫颈原位鳞癌； 甲基化； 14-3-3σ

大量的流行病学、临床及动物实验研究表明宫颈癌是high risk-HPV（HR-HPV）感染引起，宫颈癌和宫颈CIN极少由低危HPV感染引起，CIN是宫颈癌的癌前病变，宫颈CIN的分级与宫颈癌关系密切，CIN3极易转化为宫颈癌；宫颈尖锐湿疣多见于lowrisk-HPV（LR-HPV）感染。引起LR-HPV和HRHPV感染致癌潜能不同，关键在于E6、E7两个主要病毒致癌蛋白对肿瘤抑制蛋白p53和pRb的调节作用。HR-HPV感染宿主上皮细胞后，E6癌蛋白大量表达，这时E6通过E6-AP（泛素化）与p53结合，引起p53的快速降解，损伤的DNA得不到修复。14-3-3σ（stratifin，SFN）是一种重要的细胞周期负调节蛋白，参与细胞增殖周期G2-M检查点的控制，受p53直接转录调控，是p53的下游基因，而且能正反馈增强p53的活性，从而发挥抑制E6癌基因的功能［1-3］。

14-3-3σ表达缺失高频率的存在于多种上皮细胞类肿瘤中，如乳腺癌、胃癌等，其机制系14-3-3σ启动子甲基化［4，5］。我们的前期HPV感染宫颈组织的蛋白组学研究显示，14-3-3σ在HR-HPV感染的宫颈SCC［6］中低表达，国外 Sano等［7］研究结果是HR-HPV感染宫颈CIN和CC组织中14-3-3σ高表达。针对14-3-3σ在不同研究中的表达差异，本研究利用基因芯片技术对宫颈CA、宫颈CIN3+SCC组织中HPV进行基因分型检测，Q-PCR和western检测14-3-3σ的表达，并进行14-3-3σ启动子甲基化的检测，探讨14-3-3σ在LR-HPV和HR-HPV感染组织标本中的表达及其分子作用机制。

1　材料和方法

1.1材料来源 39例尖锐湿疣组织标本取自中国医学科学院皮肤病医院性病科患者；26例宫颈CIN和宫颈原位鳞癌组织标本取自于江苏省人民医院宫颈病中心及妇科，为病理确诊后的手术标本；35例对照取自于江苏省人民医院宫颈病中心锥切HPV阴性且病理排除CIN的标本；所有标本为2005-2007年博士生课题期间所取，标本获取后均立刻置液氮罐后转移到-70℃保存。

1.2主要试剂 兔抗人14-3-3σ蛋白多克隆抗体（美国 abcam公司），HPV-DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），HPV核酸扩增分型检测试剂盒（香港凯普公司），蛋白抽提试剂盒、Western Blotting检测试剂盒、ECL检测试剂盒均购自南京凯基生物公司；TRIzol（美国Thermo Fisher）、cDNA第一链合成试剂盒（美国 Thermo Fisher）、Real time PCR Master Mix （SYBR Green日本TOYOBO）；基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司DP304），甲基化处理试剂盒（美国ZYMO公司D5006），DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司DP209-03），Taq酶、PCR相关试剂（日本Takara公司R007a）。

1.3HPV分型检测 冷冻组织标本收集于1.5 mL微量离心管中，用DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取DNA，Eppendoff蛋白核酸自动分析仪检测浓度。然后严格按照HPV核酸扩增分型检测试剂盒（香港凯普公司）说明书进行操作，该试剂盒可以检测21种HPV亚型，包括高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，低危型HPV6、11、42、43、44、CPB304。

1.4组织中14-3-3σQ PCR检测 总RNA提取和逆转录cDNA的合成，组织标本总RNA提取，按照试剂盒操作说明进行。14-3-3σ引物：正义链：5-TGATCCCCAATGCTTCACAAG-3；反义链，5-GCCAAGTAACGGTAGTAATCTCC-3；产物大小为76 bp。内参照GAPDH：正义链，5-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3；反义链，5-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3；产物大小为115 bp。引物合成是由南京金斯瑞科技有限公司完成。反应体系：2x Realltime PCR Master Mix（SYBR Green）10μL，引物 MIX（F/R各为 10 μM），2 μL，模板（cDNA稀释 10倍）1 μL，0.1% DEPC水7 μL，总体积20 μL。反应条件：95℃5 min，95℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃延伸40 s。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳验证。

1.5组织中14-3-3σ的Western印迹分析 称取冰冻组织100 mg，加入1 mL冷Lysis Buffer，（10 μL磷酸酶抑制剂，1 μL蛋白酶抑制剂和 5 μL 100mM PMSF，混匀），冰上匀浆，将匀浆液4℃10 000 r/min离心5 min，留取上清，用Bradford法测蛋白质浓度，冻存备用。取适量蛋白质提取液加入等量的2x上样缓冲液，煮沸5 min后上样，每孔控制总蛋白上样量30 μg，分离胶90 V，浓缩胶60 V，200 mA转膜1.5 h，一抗1∶500稀释，二抗1∶5000稀释，使用增强化学发光（ECL），凝胶成像分析系统成像，最后使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。所有操作根据Western印迹分析试剂盒说明进行。

1.6MSP检测组织中14-3-3σ启动子甲基化 取组织标本约10 mg，参照基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司DP304）说明提取基因组DNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA的完整性，-80℃保存备用。参照甲基化处理试剂盒（美国ZYMO公司D5006）说明书进行重亚硫酸盐处理基因组DNA，然后参照DNA纯化回收试剂盒（天根生化科技有限公司DP209-03）说明书进行DNA的纯化回收。纯化后的DNA-80℃保存备用。14-3-3σ甲基化引物序列：正义链，5-TGGTAGTTTTTATGAAAGGCGTC-3；反义链，5-CCTCTAACCGCCCACCACGG-3；扩增产物大小为105 bp；14-3-3σ非甲基化引物序列：正义链，5-ATGGTAGTTTTTATGAAAGGTGTT-3；反义链，5 -CCCTCTAACCACCCACCACA-3，扩增产物大小为106 bp。PCR扩增：25 μL的PCR反应体系中依次加入ddH2O 15.5 μL，10x buffer 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，甲基化或非甲基化上下游引物各0.75 μL，DNA模板1.5 μL，MgCL2（20 μM）1.5 μL PCR反应条件：95℃总变性5 min，接着加入Taq酶1.5 U，然后95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸10 min取5 μL PCR产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳。紫外凝胶成像系统进行扫描采集图像。

1.7统计学方法 根据数据类型选择卡方检验和t检验，所有数据均在SPSS 17.0软件包中进行分析。

2　结果

2.1HPV分型结果 尖锐湿疣组：低危型感染31例（79.49%），其中HPV6阳性19例，HPV11阳性9例，HPV42阳性2例、HPV44阳性1例；高危感染3例（7.69%），均为HPV33；混合感染5例（12.82%），为HPV6合并HPV33阳性3例。HPV11混合HPV31阳性1例，HPV11混合 HPV33/35阳性1例。宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组，全为高危单一感染15例（57.69%）、高危基因型混合感染8例（30.77%）或高危基因型混合低危型感染3例（11.54%）：HPV16阳性8，HPV18阳性7例，HPV16混合HPV18阳性4例，HPV16混合HPV35阳性1例，HPV16混合33、35阳性1例，HPV18混合HPV33、HPV18混合HPV35阳性各1例，HPV6混合18、33阳性2例，HPV11混合HPV18、33阳性1例。

2.214-3-3σ mRNA表达 39例尖锐湿疣标本，14 -3-3σ mRNA表达0.735±0.096，与对照组比较0.734 ±0.037，t=0.039，P＞0.05，宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组中14-3-3σ mRNA表达为0.288±0.014，明显低于对照组0.734±0.037，t=-43.307，P＜0.05。尖锐湿疣组与宫颈癌组比较，t=17.936，P＜0.05，有统计学差异。

2.3Western blot检测14-3-3σ蛋白表达 26例CIN3+宫颈原位鳞癌组，26例中有21（80.80%）例14 -3-3σ蛋白表达基本缺失，4例低表达，2例高表达。而在对照组和宫颈尖锐湿疣组织标本中，Westernblot证明这些标本中14-3-3σ均有较高的表达。

2.414-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化情况 宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组中14-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化率为73.08%（19/26），明显高于对照组22.86%（8/35），χ2=15.25，P＜0.05，差异有统计学意义；尖锐湿疣组为17.94%（7/39），和对照组22.86% （8/35）相比，χ2=0.769，P＞0.05，差异无统计学意义（图1）。

图1　14-3-3σ基因启动子区甲基化修饰后PCR扩增凝胶电泳图

3　讨论

不同基因型HPV在生殖器部位感染引起不同临床表现及病理表现一直是值得研究的问题，LR-HPV感染与尖锐湿疣相关，HR-HPV感染可以导致宫颈CIN或宫颈癌等。本研究通过基因芯片法检测，结果显示，CA中低危基因型单一感染占79.49%，高危基因型感染7.69%，混合型感染12.82%。宫颈CIN3+宫颈SCC组，全部为高危基因型单一感染 15例（57.69%）、高危基因型混合感染8例（30.77%）或高危基因型混合低危型感染3例（11.54%）。这个结果与齐淑贞等［8］曾用luminex法检测宫颈标本中HPV分型基本一致。

14-3-3σ被认为是表皮细胞特异性标志物（human mammary epithelial 1，HME1）［9，10］，对皮肤而言14-3-3σ蛋白表达水平增加引起角化细胞从上皮细胞干细胞池中释放，同时，分化的真皮层角化细胞在层化过程中移向外层皮肤层，另外，它在分化的鳞状上皮细胞中含量也比较丰富，所以在本研究表现为表皮过度角化的宫颈CA标本中，14-3-3σ表达是增加的，但它与对照组相比（Q-PCR），t=0.039，P＞0.05，无统计学差异，因为CA仅是表皮细胞的增生活跃，或细胞成熟延迟使表皮细胞不能及时成熟角化脱离，并未引起质变。

14-3-3σ是抑癌基因，位于p53的下游，其负反馈调节机制有（1）细胞增殖周期 G2-M检查点（checkpoint）的控制：14-3-3σ含有细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）结合基序，当细胞DNA受到损伤时，抑瘤蛋白p53诱导14-3-3σ表达，上调的14-3-3σ蛋白通过与CDK1、CDK2、CDK4等有丝分裂激酶结合而阻止它们进入细胞核，将细胞周期阻滞于G2/M期，以维持基因组的稳定性。同时14-3-3σ通过拮抗E6-AP对p53泛素化降解和p53核外排，以及增加p53寡聚化而增强p53的稳定性和转录调控活性［11］；（2）有丝分裂过程中蛋白质翻译的分子开关作用：14-3-3σ表达缺失在引起有丝分裂灾难的同时将导致非二倍体细胞和双核细胞的产生，增加肿瘤发生的风险［12，13］；（3）细胞凋亡信号调节作用：14-3-3σ可能竞争性抑制bad对Akt的作用，来参与对细胞凋亡的信号调控［14］。本研究的宫颈CIN3+SCC标本中，HR-HPV感染达到100%，14-3-3σ表达下调。这个结果与Holm R等用免疫组化方法研究14-3-3σ在宫颈癌低表达或缺失见于肿瘤早期阶段，与宫颈癌分型和淋巴结转移等无关的结果基本一致，但Holm未探讨与HPV感染的相关性［15］。Sano等［7］研究的结果是HR-HPV感染宫颈CIN和CC组织中14-3-3σ高表达，Syrjänen等［16］研究47.6%～72.2%HR-HPV感染宫颈CIN2-CIN3组织中14-3-3σ高表达，22.5%HR-HPV感染的宫颈CIN2-CIN3组织中14-3-3σ低表达。

CpG岛甲基化所致的14-3-3σ低表达或基因沉默被认为是肿瘤发病的重要因素之一，Liu等发现14 -3-3σ在人类黑素细胞和绝大多数黑色素瘤细胞系中处于超甲基化状态，该基因的表达沉默在人类黑色素瘤的发病中起重要作用［17］。Yi［18］发现14-3-3σ启动子甲基化存在于 4种鼻咽癌细胞系（CNE1，CNE2，5-8F，6-10B）中，而不存在于正常鼻咽部上皮细胞系 NP69中，相比于鼻咽部癌旁上皮组织的28%，14-3-3σ启动子甲基化在鼻咽癌组织中发生率更高（84%）。本研究在宫颈CIN3+宫颈原位鳞癌组中14-3-3σ基因启动子区 CpG岛甲基化率为73.08%（19/26），明显高于对照组22.86%（8/35），χ2=15.25，P＜0.05，差异有统计学意义；这个和Yi在鼻咽癌组织与癌旁组织中的检测相似。Syrjänen等［16］的研究发现大部分HR-HPV+标本14-3-3σ是高表达的，其原因系因HR-HPV感染使得14-3-3σ绕过了对G1/S和G2/M节点的控制，仅有22.5%HRHPV+标本14-3-3σ低表达系因启动子甲基化引起，这个在这项研究中占比很小的部分与我们的研究结果一致。齐淑贞等［6］前期在HPV高低危基因型感染宫颈组织的蛋白组学差异，即发现14-3-3σ在HPV高危基因型感染的宫颈CIN中表达明显减少，本研究发现这个减少系因14-3-3σ基因启动子区CpG岛甲基化所致，与多种上皮类肿瘤中14-3-3σ减少的机制相同，推测HR-HPV感染宿主上皮细胞后，E6癌蛋白大量表达，这时E6通过E6-AP（泛素化）与p53结合，引起p53的快速降解。而14-3-3σ受p53直接转录调控，它与p53结合后可以不被MDM2介导的泛素化降解，14-3-3σ基因启动子甲基化致其低表达，不能稳定p53，降解加快，抑癌功能降低，受损细胞的DNA不能正常通过G2/M检查点进行有丝分裂，有的细胞畸变成癌前细胞或癌细胞［19］。

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（收稿：2016-03-24 修回：2016-05-17）

Expression of 14-3-3σ and the detection of methylation of 14-3-3σ gene promoter in the cervix with HPV infection

QI Shuzhen1，WANG Shaoming2，ZHANG Ruili3，ZHOU Binbing4，YOU Zhixue4，SU Xiaohong1，WANG Qianqiu1.
1.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences，Nanjing 210042，China；2.Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China；3.Department of Dermatology，Wuxi Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Wuxi NO.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；4.Department of Gynecology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China
Corresponding authors：WANG Qianqiu，E-mail：wangqq@ncstdlc.org SU Xiaohong，E-mail：suxh@ncstdlc.org

Objective：To detect the level of methylation of 14-3-3σ gene promoter region，and the expression of 14-3-3σ mRNA and protein in cervix with HPV infection.Methods：The levels of methylation of 14-3-3σ gene promoter CPG island，and the expression of 14-3-3σ mRNA and protein were detected by methylation-specific PCR，Q-PCR and western-blot respectively in 39 cases with cervical condyloma accuminatum（CA），35 controls and 26 cases with cervical intraepithelial neoplasia（CIN3）complicated with cervical squamous cell carcinoma（SCC）.Results：The rate of the methylation of 14-3-3σ gene promoter CPG island in the samples of SCC was 73.08%，which was higher than that in control group（22.86%），with a significant difference（P＜0.05）.There was no significant difference in the rate between the samples of CA （17.94%）and of controls（P＞0.05）.The expression of 14-3-3σ mRNA and protein in the patients with CIN3 complicated with SCC was lower than that in controls（P＜0.05）.The expression of 14-3-3σ mRNA and protein in the patients with CA was higher than those in controls（P＜0.05）.Conclusion：The reduced expression of 14-3-3σ in the patients with CIN3 complicated with SCC may be associated with the hypermethylation of 14-3-3σ gene promoter region.

condyloma accuminatum；HPV；CIN；squamous cell carcinoma；methylation；14-3-3σ

苏晓红，E-mail：suxh@ncstdlc.org

若干皮肤病性病省内诊疗体系建设与转化医学研究（编号：BL2012007）

1中国医学科学院皮肤病医院，南京，210042

2中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所，北京，100021

3南京医科大学附属无锡第二医院皮肤科，江苏无锡，214002

4南京医科大学第一附属医院妇科，南京，210029

王千秋，E-mail：wangqq@ncstdlc.org