病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黄金林



病原菌新基因功能的研究策略

杜雪晴，黄金林

随着高通量测序技术和蛋白组学技术的发展，越来越多的病原菌新基因被发现，研究病原菌新基因有助于更好的防控由该病原菌引起的疾病的传播。本文从生物信息学角度、新基因功能获得与缺失、与新基因编码产物互作蛋白的分析等方面综述了适用于病原菌新基因功能研究的策略，为基因分子生物学等相关领域提供参考。此外，本文还结合常规的新基因研究方法，将芯片技术，2D-DIGE技术渗透入病原菌新基因研究策略中，使研究者能更快捷准确的找出新基因功能研究的切入点，进而制定切实可行的新基因功能的研究方案。

病原菌新基因；生物信息学；基因功能；蛋白质相互作用

随着全基因组测序技术的快速发展，利用转座插入突变体偶联测序技术从病原微生物基因组中筛选新基因越来越准确快捷，但阐明新基因编码蛋白的生物学特性、生物学功能、与临床医学之间的关系、新基因表达调节机制还十分困难，病原菌新基因功能研究仍然是分子生物学研究领域中具有挑战性的工作。通常对于新基因功能的研究，首先是利用数据库中已有的信息对新基因进行生物信息学分析；其次应用分子生物学技术对该基因进行体内或体外分析，并通过体内筛选与该基因编码蛋白相互作用的蛋白进一步确证该基因在病原菌致病过程中发挥的作用。

1　新基因生物信息学分析

生物信息学(Bioinformatics)是随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，由生命科学和计算机科学相结合形成的一门新学科。目前，各类病原微生物基因及蛋白信息数据库已更新的相对完备，生物信息学分析也成为新基因功能研究的首选方法[1]。利用数据库中已有的信息可快速了解与新基因功能有关的信息，初步推测新基因可能的功能，据此制定进一步的研究方案。

1.1新基因序列分析生物信息学的核心是基因组信息学，即以基因组DNA序列的信息分析为基础寻找发现新基因[2]。新基因序列分析包括碱基序列基本参数分析以及序列同源性比对。序列基本参数统计包括分子质量、GC百分含量、融合温度(Tm值)、摩尔消光系数等核酸序列基本指标的计算[3]。可通过一些常用软件如JaMBW软件包中的工具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等进行综合计算(http://www.bioinformatics.org/JaMBW/)。随后进行新基因序列同源性分析，包括基因序列同源性和氨基酸序列同源性分析，如应用NCBI数据库中BLAST程序进行基因序列比对，应用Uniprot数据库中的BLAST程序进行蛋白序列比对(http://www.uniprot.org/)等。通过比对发现与新基因或氨基酸序列高度同源的基因或蛋白，通过这些已知基因或蛋白的信息推测未知基因的功能。Gao等[4]于2014年应用转座突变体偶联二代测序技术发现变形菌属弯曲菌基因组中的一些变形菌属特异新基因，通过序列与结构同源性分析初步推知所筛选的新基因的功能。

1.2新基因编码产物的分析首先可以对新基因编码产物进行理化性质分析，其次运用swiss-model预测蛋白结构，并进行结构同源性分析，通过比对后获得结构同源性较高的已知蛋白，可以推测未知基因蛋白的功能。此外预测病原菌新基因编码产物的结构域，功能域对于制定后续蛋白功能研究策略具有至关重要的意义。如预测该蛋白是否有信号肽(SignalP4.0)、跨膜结构(TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)以及脂蛋白信号肽等可以推测该蛋白是否为膜蛋白或分泌性蛋白。 Marchant等[5]综述了多个空肠弯曲菌Tlp蛋白预测受体和跨膜信号肽结构域，使我们更好的了解空肠弯曲菌的趋化机制。

2　新基因功能获得与失活

了解病原菌新基因功能最直观的方法就是对该基因体内过表达或失活。通过观察病原菌表型变化或者生理生化特性的改变分析该基因可能的功能。

2.1新基因功能获得方法在新基因上游加入可调控原件并通过载体转入某一特定的细胞中(也可以是新基因突变株)，使其过表达，观察该细胞生物学特性以及生理生化反应，代谢等方面的变化，从而了解该基因的功能，如果是转入细胞中称为转染，基因转染运载系统分为非病毒方法和病毒方法。非病毒方法又分为化学转染法，生物转染法及物理转染法。另一种转染运载系统是病毒作为载体，其优势有能够在转化细胞中将目的基因稳定遗传，其次能够将克隆的基因作为病毒染色体的一部分，并且能够进行分离，最重要的是转化效率高[6]。Marijke Keestra等[7]将鼠伤寒沙门菌sipA基因构建到真核表达质粒并转染HEK293细胞，发现该基因编码毒力因子能够激活NOD1/NOD2信号通路。转化是构建新基因过表达株最常用的方法，应用诱导型高效表达质粒将新基因转入该基因的突变株。转化方法有电转化和热激法。

2.2新基因功能失活方法观察病原菌在新基因功能被部分或者全部失活后，生物学行为或表型变化来鉴定新基因的功能。为使基因功能失活可以使该基因敲除、突变或者缺失，也可以从转录水平进行干扰蛋白的合成但该类方法极少用于病原菌的研究。基因水平的失活方法有基因敲除技术(主要用于动物模型的建立)、基因缺失技术和基因突变技术。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础，运用基因同源重组进行基因敲除是构建基因敲除动物模型最普遍使用的方法[8-9]。Robert等[10]于2007年建立了myd88基因敲除小鼠模型，发现nramp1基因在弯曲菌感染中发挥作用。病原菌最常用的基因功能缺失方法就是使该基因突变。Red同源重组系统是常用的构建病原菌突变株的方法，运用高效自杀载体系统同样能达到基因突变的目的。前者相对后者操作简单，但在某些病原菌中还没有应用[11-12]。Kao等将csrA与rpoN基因突变后幽门罗杆菌J99运动力及粘附能力均显著下降，说明csrA，rpoN影响幽门杆菌J99鞭毛发挥正常作用[13]。 Malik Tareen 等[14]将空肠弯曲菌cj0268c基因突变后，粘附侵袭Caco-2细胞的能力均有下降，说明该基因与弯曲菌粘附侵袭能力有关。

转录水平的基因沉默即干扰mRNA翻译成蛋白质这一过程。此类技术常用于真核生物及病毒的研究。原核生物由于转录和翻译几乎同时进行，所以干扰mRNA的翻译有一定的局限性。目前最为常用的基因沉默技术是RNAi技术，该技术利用与靶mRNA具有同源性microRNA与阿尔法古蛋白家族形成RNA沉默复合体，特异性结合并降解靶mRNA[15]。大量研究表明RNAi技术在医学研究中用于治疗多种疾病大有前景[16-18]。如 Peer等[19]利用β7-targeted siRNA 治疗小鼠肠炎，β7-targeted siRNA的靶分子是编码细胞周期素(CyD1)的mRNA，能够特异性的与之结合并降解，从而使肠道上皮细胞炎性有一定的恢复。

3　病原体基因表达水平的检测

病原菌新基因功能失活或过表达后，若能得知某些已知基因上调或下调表达，那么该基因与上调或下调表达的已知基因的功能定存在直接或间接关系。

3.1mRNA表达水平的变化检测mRNA表达量的传统技术有实时定量RT-PCR技术及Northern Blot，二者皆能够定量检测mRNA的转录水平变化，但也各有不足，实时定量RT-PR成本较高，而Northern Blot操作较为繁琐，且使用放射性元素标记，会产生放射性污染。因此在实际研究中，研究者需根据实验需求而选择，二种实验技术互相补充有时是必要的。

基因芯片是当下较为热门的一项技术。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息[20-21]。基因芯片是分析新基因功能的优良工具[22]。Gong等[23]使用基因芯片技术等发现malS 5′-UTR(ncRNA)可调控bax基因的表达，因此malS 5′-UTR(ncRNA)影响鼠伤寒沙门菌的侵袭能力。RNA-Seq技术是近年来新兴的高通量表达谱分析技术，尽管目前为止该技术发展并没有成熟，但具有很好的应用前景[24]。Butcher等[25]应用RNA-seq技术分析了空肠弯曲菌编码铁激活蛋cjfur，cjperR基因缺失株的转录组变化，发现在铁离子缺少的情况下，铁依赖基因差异表达。

3.2蛋白表达水平的变化蛋白芯片技术继基因芯片技术之后又一新型技术。它的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达量[26]。2D-DIGE技术也是用于研究蛋白组学的一项有力技术[27]。首先将样品分别用不同的荧光标记(如Cy2，Cy3)，并将2种样品等量混合，同时在一块胶上进行电泳，然后将跑好的2D图像用激光经不同的滤光器后进行荧光信号分析，根据荧光信号的比例定量分析上调表达与下调表达的蛋白[28]。Condell 等[29]应用2D-DIGE技术分析沙门菌耐受三氯生抗菌剂的蛋白组学，结合质谱鉴定技术，对野生株ST23与突变株ST23M比较蛋白组学分析发现有18个上调表达蛋白，9个下调表达蛋白，这说明2D-DIGE技术可以用来分析新基因缺失后与野生型蛋白表达差异。

4　新基因编码产物与已知蛋白相互作用研究策略

蛋白-蛋白之间的相互作用贯穿于细胞生命活动的每个过程，包括DNA的复制、转录、翻译、拼接以及分泌，多数蛋白质以复合体的形式存在。研究蛋白之间的相互作用是阐明蛋白作用机制和生物学功能的基础。

4.1体外GST pull-down技术谷胱甘肽S转移酶pull-down(glutathione S-transferase pull-down，GST pull-down)技术利用GST对谷胱甘肽的亲和作用，从蛋白混合液中分离出相互作用蛋白，是进行体外研究蛋白相互作用的有效方法[30]。

目前，GST pull-down已广泛应用于蛋白互作研究领域，该技术可联合质谱法筛选与已知蛋白相互作用的靶蛋白，也可以对已知的相互作用蛋白进行验证。黄勇等[31]用GST pull-down技术验证大肠杆菌YggG与Era蛋白之间存在相互作用，说明该基因的表达与大肠杆菌的环境应激相关，提示yggG基因产物参与细菌的应激调控。2010年，Kanno等[32]表达GST-Rab1-43蛋白，运用GST pull-down联合质谱法筛选出哺乳动物单体GTP酶的效应因子。Minamino 实验室[33-35]先后3次使用GST pull-down 技术证明 FliI ATPase 和鞭毛伴侣蛋白FliT 在沙门菌SJW1368鞭毛蛋白输出过程中具有相互作用，鞭毛伴侣蛋白FlgN分别与FlgK，FlgL鞭毛蛋白C端结合以防止二者在运输过程中被水解以及鞭毛伴侣蛋白FlgN和FliT的C端残基分别与FlhAC相互作用，证实FlhA在鞭毛丝合成过程中发挥一定作用。该方法不足之处在于缺乏体内生理条件，且不能检测到蛋白间的瞬时作用。另外，该技术需要足量的活性蛋白，因此具有一定的局限性；GST标签也可能会影响蛋白的空间结构，从而造成假阴性结果。

4.2胞内免疫共沉淀技术另一种检测蛋白相互作用常用的方法是免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)。免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定2种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法[36]。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。Lung 等[37]应用Co-IP技术证实大肠杆菌中其他与T3SS毒力蛋白NleB1相互作用的蛋白，丰富了该蛋白的毒力功能。黄琪等[38]利用免疫共沉淀联合质谱分析，在卡介苗(BCG)中筛选与PPE蛋白家族Rv3425相互作用的蛋白，发现Rv3425与Rv3614c相互作用，推测Rv3425可能与ESX-1蛋白分泌系统及结核分枝杆菌致病机制密切相关。该技术与普通的ELISA和Western-blot技术相比，使用的抗体需达到一定的浓度并对相应抗原有较高的亲和力，否则会出现假阳性现象。另外针对诱饵蛋白的特异性抗体可能与相互作用蛋白竞争性结合，从而影响相互作用蛋白复合物的稳定性[39-40]。

5　展　望

笔者相信随着生物技术的不断发展，未来高通量大规模测序技术会普及于生物学领域，因此将会有更多的病原菌新基因被挖掘。另外，基因及蛋白数据库不断完善，这对后续新基因研究提供更多的依据。研究病原菌的新基因能够更深的了解该病原菌的特性，与临床医学的关系，以及致病机制，对于因该病原菌引起的疾病的防控具有重要意义。本文虽然主要综述病原菌新基因功能的研究策略，但许多技术也适于其他生物的新基因功能的研究，希望本文能为从事本行业工作的研究者们提供借鉴。

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Strategy for pathogen novel gene function research

DU Xue-qing, HUANG Jin-lin

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

With the development of high-throughput sequencing technology and proteomics technology, more and more pathogen novel genes were discovered. To explore novel genes of pathogen is helpful to prevent and control the diseases caused by these pathogen better. In the perspective of bioinformatics, acquisition and deletion of novel gene, analysing novel gene encoding product, this article reviews strategies that are suitable for the research of pathogenic bacteria novel gene, which provides a reference for genetic and molecular biology. Combined with conventional methods, this article penetrates chip technology, 2D-DIGE technology into the pathogen novel gene research strategy. It enables researchers to find a new breakthrough of gene function research and further formulate feasible research plan of novel gene function.

pathogen novel gene; bioinformatics; gene function; protein interaction

Supported by the National Natural Science Foundation of China Grant (No.31372449) and the National Key Technology R&D Program (No. 2014BAD13B02)

Huang Jin-lin, Email: jinlin@yzu.edu.cn

黄金林，Email：jinlin@yzu.edu.cn

扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009

R378

A

1002-2694(2016)07-0665-05

2015-11-26；

2016-04-24

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.015

国家自然科学基金(No.31372449)、国家支撑计划(2014BAD13B02)