青钱柳种质资源亲缘关系的ISSR分析评价

陈秀娟，柏明娥*，王丽玲，张都海，徐高福，王燕飞

(1.浙江省林业科学研究院，杭州310023；2.淳安县新安江开发总公司，浙江淳安311700；3.龙泉市林场，浙江丽水323700)



青钱柳种质资源亲缘关系的ISSR分析评价

陈秀娟1，柏明娥1*，王丽玲1，张都海1，徐高福2，王燕飞3

(1.浙江省林业科学研究院，杭州310023；2.淳安县新安江开发总公司，浙江淳安311700；3.龙泉市林场，浙江丽水323700)

利用ISSR分子标记，对从浙江、江西、湖南等地收集的38份青钱柳种质资源的亲缘关系进行分析评价。结果表明：(1)从100对ISSR引物中筛选出16对，能扩增出108条多态性条带，多态率为67.5%，表明青钱柳种质资源的种内变异较为丰富；(2)38份材料间的遗传相似系数在0.118～0.667，浙江淳安姥山林场2号与江西修水1号遗传相似系数最大为0.667，亲缘关系最近；浙江安吉天荒坪4号和浙江遂昌白马山3号遗传相似系数最小为0.118，亲缘关系最远；(3)聚类分析表明在遗传相似系数为0.330时可将38份青钱柳种质分为2组，第1组包括37个样品，第2组仅包括浙江遂昌白马山1号1个样品；在遗传相似系数为0.368时可将第1组再细分为2个小组，第1小组包括23个样品，以浙江种质居多，第2小组包括14个样品，以浙江遂昌和湖南种质为主。本研究结果从分子水平上反映了青钱柳不同地理种源间的变异程度和亲缘关系，可以为合理引种、保护和优良种源筛选提供参考依据。

青钱柳；种质资源；亲缘关系；ISSR

青钱柳[(Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinsk.)]系胡桃科(Juglaruiaceae)青钱柳属植物，是冰川世纪幸存下来的珍稀树种，为我国特有。青钱柳为落叶乔木，树干通直，果实为坚果，扁球形，中部围有水平方向的革质圆盘状翅，形似铜钱，可作为速生用材及园林观赏树种[1]。青钱柳种子具有休眠特性，一般播种后需隔年萌发，自然萌发率低[2-3]。研究表明青钱柳中含有多种有机或无机类化学成分，如黄酮[4]、多糖[5]、三萜类化合物[6]、酚酸类化合物[7]及钾、钙、镁、铁、锌、铜、硒等无机元素[8]，具有降血糖[9]、降血压[10]、降血脂[11]和提高机体免疫力等多种功能[12]。青钱柳分布范围较广，主要分布于我国亚热带地区的江西、浙江、安微、福建、湖北、四川、贵州、湖南、广西、重庆、江苏等省(市)，河南、陕西和云南省也有少量分布，多生于海拔420～1100m(东部)或420～2500m(西部)的山区、溪谷、林缘、林内或石灰岩山地，喜生于温暖、湿润、排水良好的酸性红壤、黄红壤之上[13-14]。青钱柳在我省的安吉、杭州、临安、淳安、建德、宁波、天台、开化、仙居、遂昌、龙泉、庆元、云和、丽水、瑞安等地均有零星或小片状分布[15]。随着青钱柳药用价值的开发，大规模掠夺式和破坏性采集资源现象严重，导致对自然植被不同程度的破坏，许多地区的青钱柳自然居群逐渐缩减，再加上青钱柳种子败育率高，自然更新能力弱，在一定程度上也限制了其发展。因此对青钱柳种质资源的保存、保护非常重要。

青钱柳作为第三纪孑遗物种，起源古老，在长期进化过程中受地理环境等因素的自然选择或人为选择使种质间产生了一定的遗传变异，这种遗传变异不仅表现在物种形态上，同样也体现在分子水平上。如佘诚棋等[16]的研究表明，青钱柳种子性状在群体间和群体内均达到显著差异，不同种源青钱柳复叶性状、地径和苗高均存在显著差异[17]；周一砀等[18]的研究表明，青钱柳种质资源厍的遗传多样性丰富。DNA分子标记技术作为品种鉴别、物种间亲缘关系分析等的一种有效手段，已在多种植物的研究中得到应用[19-21]。ISSR(inter-simple sequence repeats)是1994年由Zietkeiwitcz创建的一种简单序列重复间扩增多态性分子标记方法[22]，具有操作简单快捷、DNA用量少、技术要求和成本低等特点。本文利用ISSR分子标记技术对浙江、江西、湖南等地收集的38份青钱柳种质资源材料进行亲缘关系的分析评价，以期为青钱柳种质资源的保存、保护及分子辅助选育提供理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试青钱柳种源分别采自浙江、江西、湖南、贵州等地(见表1)，其中19号、20号、21号分别为浙江淳安姥山林场、浙江安吉天荒坪和浙江遂昌白马山母树群采集种子后培育的1a生实生苗种源，其余均为自然分布种源。采样时选取无病虫害的幼嫩叶片，硅胶干燥封存后带回实验室于-70℃保存备用。

表1　供试青钱柳种源与采集地点

1.2试验方法

1.2.1基因组DNA的提取。基因组提取采用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(BioTeke，北京)，DNA提取后通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 2000C 微量核酸蛋白测定仪检测完整性、纯度及浓度。D260 /D280 > 1. 8 的DNA 样品用于后续 PCR 扩增。

1.2.2ISSR引物筛选和PCR的扩增。从38份样品中选择5份样品进行ISSR引物筛选，共获得16条扩增条带清晰、稳定的多态性引物(见表2)。

表2　供试ISSR引物序列

利用这16条引物对38份青钱柳的DNA样品进行 ISSR-PCR扩增。ISSR扩增反应采用20μL体系：10. 0μL 2×Power Taq PCR MasterMix，模板DNA 60 ng，ISSR 引物1μL (10μmol/L) ，ddH2O补足20μL。PCR扩增反应在杭州博日公司的TC-XP 型扩增仪上进行。ISSR-PCR 扩增程序为 94℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，循环结束后72℃延伸7min，4℃保存。PCR样品的分析采用毛细管电泳。

1.2.3数据处理与统计分析

PCR 扩增产物用毛细管电泳分析后，根据实验结果，分析记录同一大小重复出现的条带，在相同的迁移大小上，有带用1表示，无带用0表示。采用 NTSYS-pc 2.10e 软件进行遗传多样性分析，使用软件中的SimQual程序计算样品间的Dice遗传相似系数，用SAHN程序进行UPGMA(非加权成对算术平均法)聚类分析，通过Tree plot模块生成聚类图。

2　结果与分析

2.1扩增产物的多态性分析

利用筛选出的16条ISSR引物对青钱柳基因组DNA进行PCR扩增，毛细管电泳结果显示均能扩增出清晰稳定、重复性和多态性较高的条带。这16条引物共扩增获得160条ISSR条带，条带大小介于100～1000 bp，其中多态性条带数108条，多态率为67.5%，表明38个青钱柳种质间的基因组差异明显，种内变异较为丰富。

图1　引物820对4号青钱柳样品的扩增图谱

2.2遗传相似性分析

将16条引物扩增出的条带作为原始矩阵，利用 NTSYS-pc 软件计算38份种质间的 Dice 遗传相似系数，遗传相似系数介于0.118～0.667，平均为0.409。其中浙江淳安姥山林场2号与江西修水1号之间的遗传相似系数最大为0.667，表明两者间的亲缘关系最近；其次为浙江富阳2号与4号，遗传相似系数为0.647。亲缘关系最远的为浙江安吉天荒坪4号和浙江遂昌白马山3号，遗传相似系数最小为0.118，其次为湖南绶宁与浙江安吉天荒坪4号，遗传相似系数为0.151。38份试样间的遗传相似系数详见表3。

表3　38份青钱柳种源间的遗传相似系数

接表3　38份青钱柳种源间的遗传相似系数

2.3聚类分析

图2　青钱柳种质资源UPGAM聚类图

利用UPGMA法对38份青钱柳材料进行聚类分析，建立聚类分支树状图(图2)。在遗传相似系数为0.330时可将38份青钱柳样品分为2组，第1组包括37个试样，第2组仅包括15号浙江遂昌白马山1号1个试样，在遗传相似系数为0.368时可将第1组37份试样再细分为2个小组，第1小组包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、27、28、29、33、34、35、37、38号共23个试样，本组以浙江种源居多，浙江清凉峰、富阳、安吉天荒坪、杭州午潮山、宁波四明山等地种源全部归于此组，另江西修水1号和2号、浙江开化古田山2号、浙江淳安姥山林场1号和2号、浙江遂昌1年生苗及贵州榕江平阳的种源也归于此组；第2小组包括16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、30、31、32、36号共14个试样，主要以浙江遂昌和湖南等地种源为主，另包括浙江淳安姥山林场3号和4号、浙江淳安姥山林场1年生苗、浙江安吉天荒坪1年生苗、开化古田山1号、江西中源种源。从以上聚类结果可以看出，来自相同地区的青钱柳样品大都聚于一起，如浙江清凉峰、富阳、安吉天荒坪等，呈现出一定的地域性分布规律，但各地种源并未严格按地理界限聚在一起。

3　结论与讨论

青钱柳作为一种很有发展前景的多用途珍贵树种已引起人们极大的关注，相关研究及报导较多，但有关分子生物学方面的研究尚少。本研究利用ISSR分子标记技术从基因组水平揭示了青钱柳种质资源的遗传差异及亲缘关系，进而分析其遗传多样性，有助于青钱柳种质资源的保护。从ISSR-PCR扩增结果看，16对引物共扩增获得160条ISSR条带，多态性条带百分率达67.5%，表明青钱柳在DNA水平上具有丰富的遗传多样性。遗传相似性系数是用来比较群体或个体间相似程度的度量参数，平均相似系数越高，说明相似程度越大，遗传背景一致性越强[23]。分析结果表明38份青钱柳种质的遗传相似性系数在0.118～0.667，平均为0.409，其遗传相似性系数总体比较低，说明青钱柳种质在长期的适应和进化过程中形成了广泛的遗传变异，个体间遗传差异较大。38份种质中亲缘关系最近的为江西修水1号与淳安姥山林场2号，遗传相似系数最大为0.667，亲缘关系最远的为浙江安吉天荒坪4号和浙江遂昌白马山3号，遗传相似系数最小为0.118，青钱柳种质间亲缘关系的远近与地理距离间没有形成一定的相关性。

进一步的聚类分析表明来自相同或相近地区的多数种质可以聚于一起，如浙江清凉峰、富阳、安吉天荒坪、杭州午潮山、宁波四明山等地的种质基本聚于一组，呈现一定的地域性分布规律，表明这些地区的种质相似度较高，遗传背景较为一致。但各地种质并未严格按地理界限聚在一起，出现一定的交叉现象，如江西修水、贵州榕江平阳的种质与上述种质聚于一组，湖南绥宁、湖南张家界种质基本与浙江遂昌种质聚为一组，这可能与种质资源的自然迁移或人工移栽等因素有关。值得关注的是，聚类图显示位于浙江遂昌境内的白马山1号种质单独聚为一组，提示该种质在遗传背景上可能与其它种质存在较大程度的差异。因此，可考虑进一步开展该种质的生物学性状、化学成分等方面的研究，为青钱柳优良种源选择和推广应用提供一定的理论依据。

[1]谢明勇,谢建华.青钱柳研究进展[J].食品与生物技术学报,2008,27(1)：113-121.

[2]李海玲,方升佐.青钱柳繁殖技术研究进展[J].林业科技开发，2005，19(3):3-5.

[3]徐高福,柏明娥,朱杭瑞,等.青钱柳的多功能价值与繁育利用技术研究进展[J].林业调查规划,2013,38(5):32-34.

[4]谢明勇,王远兴,易醒,等.青钱柳叶中黄酮化合物结构及含量研究[J].分析化学,2004,32(8):1053-1056.

[5]李磊,谢明勇,易醒,等.青钱柳多糖组分及其降血糖活性研究[J].江西农业大学学报,2001,23(4):484-486.

[6]舒任庚,刘玉凤,陈杰,等.青钱柳植物中三萜成分的研究[J].中药材,2007,38(4):507-508.

[7]舒任庚,舒积成.青钱柳中的酚类化学成分[J].中草药,2005,28(7):558-559.

[8]李磊,谢明勇,邓泽元,等.青钱柳无机元素的初级形态分析[J].南昌大学学报:工科版,2000,22(1):74-77.

[9]上官新晨,陈木森,蒋艳,等.青钱柳多糖降血糖活性的研究[J].食品科技,2010,35(3):82-84.

[10]黄敬耀,楼兰英,徐膨.摇钱树叶的药理研究[J].中药通报,1986,11(11)：61.

[11]黄明圈,上官新晨,徐明生,等.青钱柳多糖降血脂作用的研究[J].江西农业大学学报,2011,33(1):157-161.

[12]黄贝贝,肖凤仪,张文平,等.青钱柳对小鼠免疫功能的影响[J].江西中医学院学报,2004,16(5):59-60.

[13]中国科学院“中国植物志”编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2004.

[14]方升佐，洑香香.青钱柳资源培育与开发利用的研究进展[J].南京林业大学学报(自然科学版),2007,31(1):95-100.

[15]浙江植物志编辑委员会.浙江植物志[M].第二卷.杭州：浙江科学技术出版社,1986：28-29.

[16]佘诚棋,杨万霞,方升佐. 青钱柳天然群体种子性状表型多样性[J].应用生态学报,2009,20(10):2351-2356.

[17]余诚棋,杨万霞,方升佐,等.青钱柳种源间苗期性状变异分析[J].南京林业大学学报(自然科学版),2010,34(1):34-38.

[18]周一砀,袱香香,尚旭岚,等.青钱柳种质资源多样性SRAP初步分析[J].基因组学与应用生物学,2011,30(1)：40-46.

[19]刁松锋，邵文豪，姜景民，等.多用途树种无患子ISSR-PCR体系建立与检测[J].广西植物，2015，35(6)：899-904.

[20]肖政,苏家乐,刘晓青,等.基于ISSR标记的杜鹃花种质资源遗传多样性分析[J].江西农业学报,2015，27(11)：6-10.

[21]张怀山,夏曾润,栗孟飞,等.中型狼尾草种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].西北植物学报，2014,34(2)：0256-0264.

[22]Zietkiewicze，Rafalskia，Labudad.Genome fingerprinting by simple sequence repeats(SSR)-anchored PCR amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[23]朱波,华金渭,刘昆,等.珍稀药材三叶青种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].江西农业大学学报,2015,37(5)：914-919.

2016-04-10

浙江省科技厅公益技术研究农业项目(2013C32087)；遂昌县科技计划项目(2014-17-08)

陈秀娟(1973- )，女，助理工程师，主要从事林业资源管理；*通讯作者：柏明娥(1966- )，女，研究员，硕士，主要从事资源植物开发利用技术研究，E-mail:1683317628@qq.com。

S792.12

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.002