鹿茸活性肽的分离提纯及成分测定

杨阳

（黑龙江省野生动物研究所，哈尔滨　150081）

鹿茸活性肽的分离提纯及成分测定

杨阳

（黑龙江省野生动物研究所，哈尔滨150081）

采用醇沉法、Sephadex G-25层析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M层析法分离提纯鹿茸活性肽，得到的鹿茸活性肽纯度较高，为79.397%，分子量为3 000～3 200 Da，并含谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸等14种氨基酸。

鹿茸；活性肽；分离；提纯

鹿茸中含有很多活性物质，传统的加工方法易使鹿茸产品中的活性物质遭到破坏而不能被充分利用，因此采用科学的方法分离提纯鹿茸活性肽成分，并对其进行性质分析，能够提高鹿茸的利用率，促进我国珍贵药材鹿茸的开发和利用。

1　试验材料

梅花鹿二杠鲜茸（冷冻保存）；葡聚糖Sephadex G-25；TOYOPEARLGiga Cap s-650M；超低分子量Marker；乙酸—乙酸钠（HAc-NaAc）；95%乙醇；醋酸—醋酸钠缓冲溶液。

2　试验方法

2.1鹿茸活性肽的粗提

取冻存（-18℃）的梅花鹿二杠鲜茸1 kg，冷冻切片，加入3000mL预先冷却的200μmo1/L pH3.5的醋酸—醋酸钠缓冲溶液，放置过夜。8 500 r/min离心20 min，取上清液，加入95%乙醇使其终浓度达到65%，4℃放置并搅拌，4 h后8 500 r/min离心20 min，取上清，在真空旋转蒸发仪55℃中蒸发，回收乙醇，最终浓缩体积约为400 mL，得到鹿茸粗提物，-20℃保存备用。

2.2鹿茸活性肽的精提

通过查阅资料、预试验，确定通过SephadexG-25层析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M层析进行提纯。

2.2.1Sephadex G-25层析

将溶胀好的Sephadex G-25装入处理好的层析柱中（20mm×32cm），选用pH4.0，2mmol/L HAc-NaAc作为流动相，流速为1.5 mL/min，加入鹿茸粗提物5 mL，根据核酸蛋白检测仪显示的数值收集各峰，进行生物活性检测，将免疫活性强的组份进行下一步层析。

2.2.2TOYOPEARL Giga Cap s-650M层析

TOYOPEARL Giga Cap s-650M灌柱（20 mm ×32 cm）后，选用pH 3.6，5 mmol/L HAc-NaAc作为流动相，加入经Sephadex G-25纯化后活性肽，5 mL（经分子量为1 200的透析袋透析浓缩），根据核酸蛋白检测仪显示的数值收集流穿峰，然后分别使用pH 4.0、浓度为0.5和1 mol/L HAc-NaAc溶液洗脱，并收集洗脱峰，进行生物活性检测，收集免疫活性强的组份即为鹿茸活性肽的精提物。

2.3电泳检测

进行SDS-PAGE分析，测定鹿茸活性肽的分子量。

2.4活性肽的氨基酸测定

采用氨基酸自动分析仪（柱后衍生法）测定活性肽的氨基酸组成。

2.5多肽纯度的测定

采用haimagerTM2 200凝胶成像系统对电泳图的条带进行光密度扫描，测定纯度。

3　试验结果

3.1鹿茸活性肽的分离提纯

经粗提、Sephadex G-25层析和TOYOPEARL Giga Cap s-650M层析，及生物活性检测，得出免疫活性强的组份即为鹿茸活性肽精提物。

3.2电泳检测结果

使用TOYOPEARL Giga Cap s-650M阳离子交换填料的洗脱峰经电泳检测（图1）显示：鹿茸多肽的电泳图谱为一条带，表明分离得到的鹿茸多肽已较纯，与相应的Marker做对照，其分子量约为3 000～3 200 Da。

图1　电泳检测结果

3.3活性肽的氨基酸测定

从鹿茸的活性多肽中检测出14种氨基酸（表1），主要有谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸、亮氨酸等。

表1　鹿茸多肽的氨基酸含量及组成　g/100g

3.4多肽纯度测定

用AlphaimagerTM2 200凝胶成像系统对电泳检测结果中泳道2的条带进行光密度扫描（图2）显示：泳道2中鹿茸多肽的纯度为79.397%。

图2　凝胶成像扫描图谱

4讨　论

电泳检测结果为一条蛋白区带，表明分离得到的鹿茸多肽已较纯，与相应的Marker做对照分子量为3 000～3 200 Da，经AlphaimagerTM2 200凝胶成像系统扫描，纯度为79.397%，从氨基酸组成成分看，提纯的鹿茸多肽含谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸等14种氨基酸。

［1］宗颖，刘侗，王志颖.鹿茸多肽成分及其药理作用研究［J］.吉林中医药，2013（11）:1135-1137.

［2］张微，张振秋，李峰，等.马鹿茸多肽提取工艺研究［J］.中华中医药刊，2006（3）:630-632.

［3］赵玉红，张立刚，张睿.鹿茸水浴性蛋白提取条件的优化及组分［J］.东北林业大学学报，2016（7）:120-124.

第1作者简介：杨阳（1979-），女，硕士研究生，副研究员，主要从事野生动物药理毒理及产品开发工作。

（责任编辑：李丹）

Antler Active Peptide Separation，Purification and Determination of Composition

YANGYang
（Wildlife Institute of Heilongjiang Province，Harbin150081）

By the methods of alcohol sink，Sephadex G-25 chromatography and TOYOPEARL Giga Cap s-650M chromatography separation and purification method of antlr Sexpeptide.；Antler active peptide was of high purity.Molecular weight is about 3 000-3 200 Da，The purity of 79.397%，lncluding 14 kinds of amino acids.

Antler；Active peptide；Separation；Purification

S825；Q516

C

1001-9499（2016）04-0077-02

2016-06-30