NB-UVB对HaCaT细胞CCL22表达的影响

王延婷　李舒丽　杨钰琪　高天文　李春英

NB-UVB对HaCaT细胞CCL22表达的影响

王延婷李舒丽杨钰琪高天文李春英

目的： 明确NB-UVB对HaCaT细胞CCL22的影响。方法： 常规培养后的HaCaT细胞分为两组，一组给予不同剂量NB-UVB（0、100、200、400 mJ/cm2）照射；一组给予NF-κB抑制剂PDTC（1、12.5、25 μmol/L）预处理后再进行NB-UVB照射，采用Real-time PCR及ELISA检测CCL22表达；采用Western blot方法检测NF-κB p65磷酸化水平。结果： CCL22表达和NF-κB p65磷酸化的水平随着NB-UVB照射剂量增强而上调；PDTC处理后，NB-UVB诱导的角质形成细胞CCL22表达及和NF -κB p65磷酸化水平较直接给予NB-UVB明显下调，且PDTC浓度越高越明显。结论： NB-UVB照射可能通过激活NF-κB信号通路促进角质形成细胞CCL22表达及分泌。

窄谱中波紫外线； 角质形成细胞； CCL22

NB-UVB广泛应用于多种炎症性皮肤病如白癜风、银屑病、蕈样肉芽肿的治疗，疗效显著且副作用小。目前关于NB-UVB治疗皮肤病的作用机制，比较公认的观点是其可直接作用于淋巴细胞诱导细胞凋亡并减少炎症因子分泌［1］。最新研究提出，NBUVB可促进白癜风皮损局部Treg细胞数量增加，但具体机制不清［2］。CCL22作为Treg细胞皮肤迁移的重要趋化因子，在表皮中的表达水平对Treg皮肤迁移及后续功能至关重要。然而目前尚缺乏NB-UVB照射与CCL22表达关系的研究。本课题旨在体外细胞水平研究NB-UVB对角质形成细胞CCL22表达及分泌的影响，并探讨可能机制。

1　材料与方法

1.1主要仪器与试剂 UV-236B型紫外线光疗仪为德国沃曼公司生产，灯管光谱值311 nm。HaCaT细胞系本室常规保存，1640培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。细胞总RNA提取试剂盒购自日本Takara公司。兔抗人CCL22抗体购自美国Abcam公司，鼠抗人NF-κB p65单抗、兔抗人磷酸化NF-κB p65单抗均购自Cell signaling technology公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Sigma公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG购自康为世纪生物科技公司。ELISA检测试剂盒购自美国RD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及NB-UVB照射 HaCaT常规复苏、传代，使用含10%FBS的1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养。将HaCaT细胞接种于6孔板（1×105个细胞/孔），待细胞生长至50%～60%融合时更换无血清培养基，16 h后去除培养基，加入200 μL磷酸盐缓冲液（PBS）后接受不同剂量NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）照射，照射后用PBS冲洗细胞2次，予以含10%FBS的1640培养基继续培养特定时间点，收集细胞裂解液Real-time PCR检测CCL22 mRNA及蛋白表达水平，收集上清液ELISA检测培养基中CCL22的分泌水平。同上进行NB-UVB照射，予以含10%FBS的1640培养基继续培养2 h后检测NF-κB活化情况。

2　结果

2.1NB-UVB照射诱导HaCaT细胞CCL22 mRNA表达及蛋白分泌情况 NB-UVB照射后细胞裂解液中CCL22 mRNA表达水平显著升高，并呈现NB-UVB剂量依赖性（图1a）。NB-UVB照射后细胞上清液中CCL22分泌水平显著增强，与CCL22 mRNA表达变化一致（图1b）；HaCaT细胞经400 mJ/cm2NB-UVB照射后，收集不同时间点细胞上清，ELISA检测发现CCL22分泌水平呈时间依赖方式显著上调（图1c）。以上结果提示，UVB照射以剂量和时间依赖方式促进角质形成细胞CCL22的表达及分泌。

图1　a:NB-UVB照射HaCaT细胞后CCL22 mRNA表达（n=4，∗∗P＜0.01，∗∗∗P＜0.001）；b、c:NB-UVB照射HaCaT细胞后CCL22蛋白分泌（n=4，∗P＜0.05，∗∗∗P＜0.001）

图2　NB-UVB照射HaCaT细胞后CCL22表达及NF-κB信号通路活化情况

2.2NB-UVB诱导HaCaT细胞CCL22表达信号活化情况 HaCaT细胞经NB-UVB照射后2 h，随着NB-UVB照射剂量增强，磷酸化的NF-κB p65水平显著升高，同时CCL22蛋白表达水平也呈现上调趋势（图2），表明NF-κB p65信号活化可能参与NBUVB诱导角质形成细胞CCL22的表达。

2.3抑制NF-κB p65信号对NB-UVB诱导HaCaT细胞 CCL22 mRNA表达及蛋白分泌的影响 在HaCaT细胞接受400 mJ/cm2NB-UVB照射前，使用NF-κB活化的特异性抑制剂PDTC（1、12.5、25 μM）预处理30 min，发现PDTC预处理可明显抑制NF-κB p65的磷酸化（图3a），且PDTC预处理显著抑制NBUVB对HaCaT细胞CCL22 mRNA的诱导效应，高剂量PDTC（12.5、25 μM）处理组更为明显（图3b）。ELISA检测结果也显示同样的趋势（图3c）。以上结果提示NF-κB是NB-UVB诱导角质形成细胞CCL22表达及分泌的重要机制。

图3　a:PDTC抑制NF-κB活化；b:PDTC抑制NB-UVB对HaCaT细胞CCL22 mRNA表达的诱导作用（n=3，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01，∗∗∗P＜0.001）；c:PDTC抑制CCL22蛋白的分泌（n=5，∗∗∗P＜0.001）

3　讨论

NB-UVB广泛应用于临床多种炎症性皮肤病的治疗。以往研究表明，NB-UVB抑制皮肤免疫炎症反应的作用机制主要包括:抑制Th1细胞，调节Th1/ Th2的平衡；诱导淋巴细胞DNA损伤及凋亡，减少炎性细胞因子分泌；诱导真皮浅层朗格汉斯细胞凋亡、促进其向周围淋巴结迁移，以及促进表皮IL-10分泌诱导Treg细胞分化，促进Treg细胞免疫抑制功能等［1，2］。近年来，由于 Treg细胞强大的免疫抑制作用，NB-UVB照射对Treg细胞的作用成了皮肤专家关注的重点。

CCL22是介导Treg细胞组织定向迁移的重要趋化因子。针对白癜风患者Treg细胞功能研究，发现即使是外周存在正常数量的Treg细胞及功能活性，但Treg细胞皮肤迁移能力降低，皮肤局部自身免疫不能被有效抑制导致疾病发生进展［3］。随后 Klarquist等研究确定，白癜风患者皮损区Treg细胞浸润减少源于表皮趋化因子CCL22表达分泌降低［4］。最近一项研究表明，对白癜风小鼠模型予以CCL22基因枪治疗，可显著增强Treg细胞皮肤迁移，有效抑制皮肤免疫，促进白斑复色［5］。我们的研究结果显示，NB-UVB照射可以诱导角质形成细胞趋化因子CCL22表达上调，并促进其分泌。该结果为Hegazy等研究发现NB-UVB照射后白癜风皮损局部Treg细胞数量明显增多提供了合理的解释［2］。由此提示，NB-UVB照射诱导表皮角质形成细胞CCL22表达上调，促进了Treg细胞的皮肤迁移，从而抑制皮损局部免疫炎症反应达到治疗效果。

值得注意的是，Ekman等对比NB-UVB照射前后银屑病患者外周趋化因子表达变化，发现NB-UVB对患者外周CCL22以及其他Th1、Th2、Th17型趋化因子均无显著影响［6］。Shimauchi等也发现，NBUVB照射对蕈样肉芽肿患者外周CCL22表达水平亦无影响［7］。由于趋化因子介导免疫细胞迁移遵循从低浓度向高浓度迁移原则，结合我们的研究结果，即NB-UVB照射诱导表皮CCL22表达上调，支持Treg细胞自外周向皮损组织迁移的可能性。但由于受临床取材的限制，目前尚无NB-UVB治疗前后皮损局部CCL22表达及Treg细胞浸润的检测，有待进一步研究。

以往研究证实，ERK、EGFR、p38 MAPK、JNK、NF -κB、STAT1均是角质形成细胞中诱导CCL22表达的重要信号机制［8，9］，各刺激条件决定不同的活化方式。本研究结果显示，NB-UVB照射可激活NF-κB信号通路，且抑制NF-κB信号活化显著下调CCL22 mRNA表达及蛋白分泌，表明NF-κB信号是角质形成细胞CCL22表达的关键信号机制，在NB-UVB治疗炎症性皮肤病中起重要作用。

综上，本研究证实NB-UVB可通过活化NF-κB信号促进角质形成细胞表达分泌趋化因子CCL22，可能参与有效的促进Treg细胞皮肤迁移，从而抑制皮损局部自身免疫反应，达到临床治疗目的。

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［4］Klarquist J，Denman CJ，Hernandez C，et al.Reduced skin homing by functional Treg in vitiligo［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2010，23:276-286.

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［6］Ekman AK，Sigurdardottir G，Carlström M，et al.Systemically elevated Th1-，Th2-and Th17-associated chemokines in psoriasis vulgaris before and after ultraviolet B treatment［J］.Acta Derm Venereol，2013，93（5）:527-531.

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（收稿:2016-01-13 修回:2016-01-27）

Effects of NB-UVB on the exPression of CCL22 in HaCaT cells

WANG Yanting，LI Shuli，YANG Yuqi，GAO Tianwen，LI Chunying.

Department of Dermatology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China Corresponding author:LI Chunying，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

Objective:To determine the effects of NB-UVB on the expression of CCL22 from HaCaT cells. Methods:The cultrued HaCaT cells were divided into two groups.The HaCaT cells in one group were treated with different dose of NB-UVB（0，100，200，400 mJ/cm2）and those in the second group were treated with NB-UVB（400 mJ/cm2）after the pretreatment with PDTC.The expression of CCL22 was detected by Realtime PCR and ELISA.The level of NF-κB p65 phosphorylation was detected by western blot.Results:The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells treated with NB-UVB were increased as the dose of of NB-UVB was increasing.The expression of CCL22 and the level of NF-κB p65 phosphorylation in HaCaT cells pretreated by PDTC were lower than those treated with NB-UVB only and the higher the concentration of PDTC，the effects were more obvious.Conclusion:The CCL22 expression induced by NB-UVB in keratinocytes may through activation of NF-κB pathway.

NB-UVB；keratinocytes；CCL22

第四军医大学西京皮肤医院，陕西西安，710032

李春英，E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

1.2.2NF-κB抑制剂PDTC预处理实验 HaCaT常规培养，待细胞生长至70%～80%融合时更换无血清培养基，实验组予以NF-κB抑制剂PDTC（1，12.5，25 μmol/L）预处理30 min，对照组予以DMSO处理，之后进行400 mJ/cm2NB-UVB照射。培养24 h后收集细胞裂解液及上清检测CCL22 mRNA表达及分泌。

1.2.3Real-time PCR检测CCL22的表达 Trizol试剂提取细胞RNA，按照试剂盒说明反转录成cDNA后进行qRT-PCR检测。CCL22引物设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，上游引物:5’-ATCGCCTACAGACTGCACTC-3’，下游引物:5’-GACGGTAACGGACGTAATCAC-3’。β-actin为内参。

1.2.4Western blot印迹检测CCL22及NF-κB信号通路活化情况 收集实验处理组及对照组HaCaT细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（5%浓缩胶，12%分离胶）。PVDF膜经甲醇激活后转膜。转膜后用TBST稀释的5%脱脂奶粉室温封闭1～4 h，予NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65、CCL22及β-actin等一抗4℃孵育过夜。次日予以辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育50 min。使用化学发光仪检测结果。

1.2.5ELISA检测CCL22表达 收集实验组及对照组细胞上清，严格按照ELISA检测试剂盒操作说明检测CCL22分泌水平。

1.2.6统计学方法 采用Graphpad Prism 5统计软件进行分析。组间检验采用one-way anova检验法，各组数据两两比较，P＜0.05差异有统计学意义。