超声波处理对绿豆蛋白结构及功能特性的影响

杨　勇,毕　爽,王中江,李　杨,*,江连洲,*

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江齐齐哈尔 161006;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)



超声波处理对绿豆蛋白结构及功能特性的影响

杨勇1,2,毕爽2,王中江2,李杨2,*,江连洲2,*

(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室,黑龙江齐齐哈尔 161006;2.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

本实验研究了超声波作用对绿豆蛋白结构及功能性质的影响,结果表明:超声波处理后绿豆蛋白β-折叠结构含量降低,而β-转角结构含量显著增加,α-螺旋和无规卷曲的结构组成有小幅增加。随着超声功率的增强及处理时间的增长,绿豆蛋白β-折叠结构含量进一步降低,而β-转角结构含量逐渐增加。超声波处理下绿豆蛋白溶解性并未发生显著变化,但有效地增强了绿豆蛋白的表面疏水性、乳化性能、起泡性及泡沫稳定性。低强度超声功率下(200 W),四者均随时间的延长而增大,高强度超声功率下(400 W),绿豆蛋白的四种功能性质则随时间的增长而逐渐降低。

超声波处理,绿豆蛋白,结构,功能特性

绿豆是豆科植物的绿色种子,主要产于中国、日本等地区。在我国绿豆的栽培历史可追溯到两千多年前,绿豆产量和出口量也居于世界前列。绿豆中还有还含有许多活性成分,具有降血糖、降血脂等功能,降低人体中甘油三酯浓度,阻止动脉硬化的发生[1-2]。

绿豆营养丰富而均衡,不仅含有碳水化合物和磷、镁、钙等微量元素,还具有丰富的蛋白质含量。绿豆中的蛋白质含量高于25%[3],甚至高于一般肉类中的蛋白质含量。其氨基酸组成类似于其他粮食作物,但谷氨酸、赖氨酸含量远高于其他粮食作物[4]。近年来,随着人们对功能性食品的不断认识与青睐,以营养丰富、安全保健为特征的优质绿豆蛋白材料必将具有广阔的开发市场。加强对绿豆及其副产品的开发与利用,推动绿豆的产业发展,具有广阔的市场前景。

有研究表明,绿豆分离蛋白具有较好的起泡性和泡沫稳定性,可形成稳定凝胶[5]。但也有研究指出绿豆蛋白的功能性受提取方式的影响[6]。绿豆分离蛋白的制备主要采用碱溶酸沉法,利用绿豆蛋白在碱性条件下具有良好的溶解性,在酸性接近等电点条件下沉降的原理制备。但该方法制备的蛋白具有一定的弊端,在制备过程中,强酸、强碱导致绿豆蛋白的构象发生变化,形成聚集,造成了绿豆蛋白功能较差,进而限制了其在食品加工中的应用。因此,在加工中通常采用超声波改性技术对绿豆蛋白改性处理[7]。

超声波是一种弹性机械波,低频高强度超声波可用于改变食品的物理或化学属性。朱建华等[8]指出超声波处理可提高大豆分离蛋白的溶解性,起泡性和乳化性等功能性质。王小英[9]等研究发现超声处理可增加大豆蛋白的溶解性。尽管如此,超声波处理在绿豆蛋白方面的研究仍较少,不同超声波条件对绿豆分离蛋白的影响规律尚未探明。本文选用不同超声功率(200、400 W)与超声时间(15、30 min),对绿豆蛋白进行超声处理,通过红外光谱、溶解度、表面疏水性、乳化性及起泡性等方法对绿豆蛋白结构及功能等性质变化进行分析,为绿豆的精深加工提供理论基础和实践指导。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

绿豆分离蛋白,自制;其它化学试剂均为国产分析纯。

MAGNA-IR560傅里叶变换红外光谱系统美国PE公司;CR22G高速冷冻离心机日本日立公司;pHS-3D pH计上海雷磁公司;超声波细胞破碎仪(JY99-IIDN)宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1绿豆分离蛋白的提取首先将原料绿豆除杂、去皮、破碎后过60目筛,得到绿豆粉。将绿豆粉以1∶4(w/v)的比例加入正己烷,40 ℃条件下连续搅拌1.5 h后10000×g离心20 min,所得沉淀室温下干燥12 h,得到脱脂绿豆粉。

将脱脂绿豆粉按1∶10(w/v)的质量比与去离子水混合,用2 mol/L的NaOH调pH至9.0,室温下搅拌2 h后,将悬浮液在4 ℃条件下10000×g离心15 min。取上清液用2 mol/L的HCl调pH至4.5。静置后在4 ℃条件下6000×g离心20 min取蛋白溶液水洗2次。沉淀用2 mol/L的NaOH调pH至7.0后冷冻干燥[10]。干燥后即为绿豆分离蛋白,置于-24 ℃保存。所得绿豆分离蛋白的蛋白质含量达90.21%±0.63%。

1.2.2绿豆分离蛋白的超声波处理将绿豆分离蛋白与蒸馏水以1∶50的比例溶解于烧杯中并置于超声波细胞破碎仪中,水浴控制样品溶液的温度为20 ℃,在20 kHz下输出功率为(200,400 W)下处理15、30 min,超声时间3 s,间隔时间3 s。

1.2.3红外光谱分析称取绿豆分离蛋白样品2 mg,加入一定量的溴化钾至200 mg,用研钵研磨混匀,压片后再用红外光谱仪做全波段扫描(400～4000 cm-1),扫描次数64次[11]。

1.2.4溶解度的测定在100 mL烧杯中倒入30 mL去离子水,取0.5 g绿豆分离蛋白,在500 r/min下搅拌1 h,10000×g离心20 min后取上清液,采用微量凯氏定氮法测定上清液中蛋白质含量。溶解度表示为上清液中蛋白质含量占总蛋白质量浓度的百分比计算浓度[12]。

1.2.5绿豆分离蛋白表面疏水性测定绿豆分离蛋白的表面疏水性采用ANS荧光探针法测定,参考Kato和Nakai[13]的方法。具体过程为:将不同超声波处理的绿豆分离蛋白溶解于0.1 mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液中。在室温条件下搅拌1 h后以10000×g离心20 min,取上清液测定蛋白浓度,并用缓冲液将不同样品分别稀释保证浓度在0.05～0.40 mg/mL之间,然后取稀释样品4 mL,加入20 μL ANS溶液(8 μmol/L),荧光操作参数为:激发波长390 nm、发射波长468 nm、扫描速度10 nm/s、狭缝5 nm为参数,测定其荧光值。

1.2.6绿豆分离蛋白乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)的测定参考Molin[14]等人的方法,采用磷酸钠缓冲液配制质量分数为0.5%(w/v)的绿豆分离蛋白溶液20 mL,加入8 mL葵花籽油进行两步均质(13500×g,60 s),形成均一的乳化液。均质后,将乳化液分别倒入小烧杯中,用微量注射器立即从底部吸取乳化液50 μL a(0 min)与b(10 min),用0.1%(w/v)SDS稀释100倍。在500 nm下进行吸光值测定。ESI和EAI采用如下公式进行计算:

其中:T=2.303,A0为均质后乳化液在500 nm处测定的吸光值,N:稀释倍数100,C:蛋白质水溶液中蛋白质浓度(g/mL),U:乳化液中的油相体积分数(0.25);A0和A10分别是乳化液在0 min和10 min的吸光值,t为时间(本实验中为10 min)。

1.2.7绿豆分离蛋白起泡性和泡沫稳定性的测定参照Alicia等[15]方法并稍作修改。取10 mL(V1,mL)1%绿豆分离蛋白溶液(用0.1 mol/L pH6.8的Tris-HCl缓冲液配制),持续快速搅拌30 s,迅速测定泡沫的体积(V2,mL),静置30 min后再次测量泡沫的体积(V3,mL)。按下述公式分别计算蛋白样品的起泡性和泡沫稳定性:

1.2.8数据处理结果为三次测定的平均值,计算标准偏差。利用新复极差检验(Duncan’s multiple-range test)评价样品平均值间的显著性差异(p<0.05)。

表1　绿豆分离蛋白二级结构含量变化Table 1　Secondary structural content of mung bean isolate

注：不同字母表示差异显著(p<0.05)，图3～图7同。

2　结果与分析

2.1红外光谱分析结果

图1为不同超声波处理条件下绿豆分离蛋白的红外光谱。蛋白质是具有特定结构的生物大分子,它由氨基酸组成并通过肽键连接而成[16]。蛋白质的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲,其中氢键是稳定二级结构的主要作用力。

图1　不同超声波处理条件下的FT-IR光谱Fig.1　FT-IR spectra of mung bean protein dispersion of different ultrasonic treatment

本论文主要采用Peakfit软件对蛋白质酰胺I带进行解析,首先对所得红外光谱的酰胺I带进行傅里叶去卷积光谱拟合分析[17],使半峰宽(FWHM)为5 cm-1,增强因子(Enhancement factor)为1.0。各峰位的归属指认依据:1615～1637、1682～1700 cm-1为β-折叠结构;1646～1664 cm-1为α-螺旋结构;1637～1645 cm-1为无规则卷曲结构;1664～1681 cm-1为β-转角结构[18]。

如表1可知,绿豆分离蛋白的主要组成为β-折叠结构。经过超声波处理后绿豆分离蛋白的β-折叠结构含量有所降低,而β-转角结构含量显著增加,而α-螺旋和无规卷曲结构组成亦有小幅增加。二级结构组成的有序单元(α-螺旋结构和β-折叠结构)总量的降低表明超声波处理破坏了蛋白质内部结构,无规卷曲结构含量的增大表明超声波处理增加了绿豆分离蛋白无序结构的形成(即蛋白质聚集体)。同作为β-结构,β-折叠结构易优先转变为β-转角结构,因而超声波处理下β-转角结构含量增加明显,亦证明超声波处理使蛋白质结构更加松散[19]。另有研究指出,蛋白质发生聚集会导致β-折叠结构含量减少[20]。

进一步比较可知,无论在低超声功率(200 W)或高超声功率(400 W)下,随着超声波处理时间的增长,绿豆分离蛋白的β-折叠结构含量均有所降低,而β-转角结构含量逐渐增加,表明更多的β-折叠结构转变为β-转角结构是超声波处理下绿豆分离蛋白的典型变化。而在高超声功率下(400 W),随着处理时间的增长,绿豆分离蛋白α-螺旋结构含量的降低及无规则卷曲结构的增加考虑可能与过于严重的蛋白质聚集现象有关。

2.2超声波处理对绿豆分离蛋白溶解性的影响

蛋白质的溶解度可以用来度量蛋白质变性和聚集的程度,也可作为评价蛋白质功能性质的主要指标。蛋白质在植物蛋白饮料中的应用也与其溶解性有直接的关系。

超声波处理对绿豆分离蛋白溶解性的影响见图2。由图2可知,绿豆分离蛋白溶解度为69.32%±1.02%,而超声波处理下绿豆分离蛋白溶解性的并未发生显著变化,总体分布于70%左右。绿豆蛋白在超声波处理下溶解性的变化与其他植物蛋白并不相同。王小英等研究表明超声波处理可以增强大豆蛋白的溶解性,并指出超声波促使大豆蛋白聚集,从而增大了其平均相对分子质量[21];邵悦等指出超声波处理增强了花生蛋白的溶解性,其认为超声波作用超声波的微泡和湍流打破蛋白颗粒,使其粒径变小,表面积增大,次级键打开不能够再维持绿豆分离蛋白原有的有序结构,从而提高了溶解性[22]。但对比于绿豆分离蛋白,溶解性显示出并未增大的变化特点,可能的原因在于超声波处理不仅诱导了蛋白质内部结构的松散解离,同时亦造成了绿豆分离蛋白的聚集现象的发生,与红外光谱结果一致。

图2　超声波处理对绿豆分离蛋白溶解性的影响Fig.2　Water solubility(total soluble fraction)(%) for untreated(0)and ultrasonication treated mung isolate protein

2.3超声波处理对绿豆分离蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性是衡量蛋白分子表面疏水基团数目的指标。蛋白质经卷曲形成特有的空间结构,分子内部形成的疏水内核由非极性氨基酸侧链分布所导致的,亲水的外侧分布有极性氨基酸。如果一些疏水基团出现在蛋白质表面,就会使蛋白质表面也具有一定的疏水性,在维持蛋白质的三级结构的稳定和四级结构的形成中占有突出的地位。分布在蛋白表面的氨基酸残基决定了蛋白质的构象、稳定性和功能性,对蛋白质的生理功能起着非常重要的作用[23]。

由图3可知,超声波处理增强了绿豆分离蛋白的表面疏水性。200 W条件下,随着超声波时间的延长,绿豆分离蛋白的表面疏水性逐渐增大,这可能与超声波的空化作用使蛋白质分子的结构变得疏松,埋藏在蛋白质球状分子内部的侧链解离,分子内部的非极性基团暴露于分子表面有关[21];而相比于低超声功率(200 W),高超声功率下(400 W)绿豆分离蛋白的表面疏水性有所降低,并随时间的增长而逐渐降低,这种现象的发生与超声波处理下蛋白质的聚集体形成有关。

图3　超声波处理对绿豆分离蛋白表面疏水性的影响Fig.3　Surface hydrophobicity of untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

2.4超声波处理对绿豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

由图4可知,超声波处理会显著增强绿豆分离蛋白的乳化性。绿豆分离蛋白乳化性的变化趋势相似于表面疏水性的变化趋势。蛋白质作为乳化剂吸附至界面取决于疏水基团的暴露,表面疏水性的增强会提升蛋白质的乳化性[24]。当超声功率增加到400 W后,绿豆分离蛋白乳化性降低,可能是由于高能量的机械振荡改变了原来分散的蛋白空间结构,绿豆分离蛋白变性程度增大,重新形成较大分子聚集体,蛋白表面积缩小,绿豆分离蛋白的乳化性进而降低[25]。

图4　超声波处理对绿豆分离蛋白乳化性的影响Fig.4　Emulsion activity index(EAI)for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

由图5可知,超声波处理有效地改善了绿豆分离蛋白的乳化稳定性,无论是超声功率的增大还是超声时间的增长,均对蛋白乳化稳定性有增强效应,表明超声波处理是改良绿豆分离蛋白乳化性能的有效手段。

图5　超声波处理对绿豆分离蛋白乳化稳定性的影响Fig.5　Emulsion stability index(ESI)for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

2.5超声波处理对绿豆分离蛋白起泡性及泡沫稳定性的影响

当蛋白质在高速剪切作用下处理时,会有大量的气体进入溶液,形成一定的水-空气界面。溶液中的绿豆分离蛋白分子吸附在这些界面上,以达到降低界面张力的效果,促进界面形成而形成泡沫。起泡性的改变与蛋白结构解聚和物化性质的变化有关[26]。

由图6可知,经超声波处理后,绿豆分离蛋白的起泡性得以增强,在低超声功率下绿豆分离蛋白的起泡性随着超声时间的延长呈增大趋势,而在高超声功率下这种增强趋势并不显著。超声波作用有助于将绿豆分离蛋白解聚成小分子亚基,增加了气水界面的蛋白分子数目,从而不同程度的提高了起泡能力[27]。但在高超声功率条件下,绿豆分子结构进一步打开,更多的隐藏在分子内部的疏水基团和巯基暴露到分子表面,极化的蛋白分子重新形成更大的分子聚集体,分子之间通过非共价键连接,表现为界面膜的稳定性下降,起泡能力下降。

图6　超声波处理对绿豆分离蛋白起泡性的影响Fig.6　Foam capacity of samples for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

结合图7可知,超声波处理在低超声功率下有益于改善绿豆分离蛋白的泡沫稳定性,但在高超声功率下随着超声时间的增长,泡沫稳定性有所降低,这主要是由于可溶性蛋白浓度降低,产生了不溶性聚集体,因此泡沫稳定性下降,更加容易破裂[28]。

图7　超声波处理对绿豆分离蛋白泡沫稳定性的影响Fig.7　Foam stability of samples for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

3　结论

超声波处理可显著改变绿豆蛋白的结构及功能性质。超声波处理后绿豆蛋白β-折叠结构含量降低,而β-转角结构含量显著增加,α-螺旋和无规卷曲的结构组成有小幅增加。随着超声功率的增强及处理时间的增长,绿豆蛋白β-折叠结构含量进一步降低,而β-转角结构含量逐渐增加。超声波处理下绿豆分离蛋白的溶解性并未发生显著变化,说明超声波处理不仅诱导了蛋白质内部结构的松散解离,同时亦造成了绿豆分离蛋白的聚集现象的发生。但超声后绿豆分离蛋白的表面疏水性等功能性质发生变化。在低超声功率下(200 W),绿豆分离蛋白表面疏水性、泡沫稳定性、乳化性随时间的延长而逐渐增大,但高功率下又有所降低，而对于乳化稳定性，无论是超声功率的增大还是超声时间的增长都对其有增强效应。绿豆分离蛋白的起泡性,在低超声功率下随着超声时间的延长呈增大趋势,而在高超声功率下趋势并不显著。总之,超声波处理在低超声功率下有益于改善绿豆分离蛋白的功能性质,但在高超声功率下效果不明显。

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Effect of ultrasonic treatment on the structure and functional properties of mung bean protein

YANG Yong1,2,BI Shuang2,WANG Zhong-jiang2,LI Yang2,*,JIANG Lian-zhou2,*

(1.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This experiment studied the effect of ultrasonic on structure and function properties of mung bean protein.The research found that the content ofβ-sheet structure decreased after ultrasonic treatment,butβ-turn confirmation contents significantly increased,while the contents of the other two structures(α-helix and random coil)were also increased.With ultrasonic power increased and ultrasonic time prolonged,the content ofβ-sheet structure was decreased and the percentage ofβ-turn confirmation was gradually increased.Ultrasonic treatment did not change the solubility of mung bean protein,but increased its surface hydrophobicity,emulsibility,foamability and foaming stability effectively.In low intensity ultrasound(200 W),the four properties of mung bean protein isolate were all increased with treated time increase,while decreased with treated time increase under higher ultrasonic power(400 W).

Ultrasonic treatment;mung bean protein;structure;functional properties

2015-11-19

杨勇(1979-)，男，博士研究生，副教授，从事粮油加工研究，E-mail:yangyong7904@163.com。

李杨(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：粮食、油脂与植物蛋白工程，E-mail:liyanghuangyu@163.com。

江连洲(1960-)，博士，教授，从事粮油加工研究，E-mail:jlzname@163.com。

国家科技支撑计划课题(2014BAD22B00)；黑龙江省自然科学基金(ZD201302)；黑龙江省自然科学基金项目(C201331)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0069-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.005