牛干巴中降胆固醇、降亚硝酸盐乳酸菌的分离筛选及其发酵性能

宋小娟,何腊平,3,*,李翠芹,朱秋劲,范　劲

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室,贵州贵阳 550025;3.贵州省猪肉制品工程技术研究中心,贵州贵阳 550025;4.贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025)



牛干巴中降胆固醇、降亚硝酸盐乳酸菌的分离筛选及其发酵性能

宋小娟1,2,何腊平1,2,3,*,李翠芹4,朱秋劲1,2,范劲1

(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室,贵州贵阳 550025;3.贵州省猪肉制品工程技术研究中心,贵州贵阳 550025;4.贵州大学化学与化工学院,贵州贵阳 550025)

以传统发酵牛干巴作为乳酸菌筛选源,分离出18株乳酸菌,通过OPA法测定降胆固醇能力,盐酸萘乙二胺比色法测定降解亚硝酸盐能力,菌株NR7对胆固醇的清除率是22.61%,培养12 h和24 h亚硝酸盐分别降解了34.177 μg/mL和95.82 μg/mL,在pH3.0的环境中活菌率达99.50%,对0.3%的胆盐耐受性强。因此,选择NR7作为目的菌株,进一步研究其生产适应性,能够在发酵4 h后使pH迅速降低,能够在15～40 ℃环境条件下生长,能够耐受8%的NaCl和200 mg/kg的NaNO2,且真空冷冻干燥后活菌率93.62%,4 ℃条件下保藏30 d后活菌率可达89.99%。16S rRNA分子生物学鉴定,菌株NR7为植物乳杆菌。

牛干巴,胆固醇,亚硝酸盐,植物乳杆菌,发酵性能

牛干巴是回族传统腌腊制品,其营养丰富,肉质酥脆、食而不腻、闻而不腥,风味独特而深受喜爱[1]。不过传统工艺存在品质难以控制、发酵周期长等缺陷,如果能从传统发酵牛干巴中筛选出功能菌,然后对发酵工艺实施标准化控制就可以控制发酵质量和缩短发酵周期。传统发酵肉制品中的功能菌主要是乳酸菌[2-3],所以本文计划从传统发酵牛干巴中筛选功能乳酸菌。再者,随着人们生活水平的提高,更加注重健康饮食,低盐、低脂肪的食品更受人们青睐。肉制品中脂肪含量高,但脂肪对食品的感官、风味、气味、质构、口感等都有影响,然而过多的摄入会给人体健康带来危害,引起肥胖、血清中胆固醇含量升高,后者被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素[4]。WHO预测心血管疾病直到2030年,仍然是死亡的主要原因,影响两千三百万人。临床研究表明,超过正常血清胆固醇水平(>5.2 mmol)1 mmol,患冠心病的几率增加35%,同时,减少1%血清胆固醇水平将降低2%～3%的患病风险。亚硝酸盐急性中毒导致高铁血红蛋白血症,慢性中毒有致癌和致畸风险,腌腊制品中亚硝酸盐残留量也让人们对腌腊制品望而却步,但亚硝酸盐具有维持人体一氧化氮平衡,促进心血管健康的作用[5]。

而研究报道表明不少乳酸菌能降低亚硝酸盐和血清胆固醇,防止癌症,所以为了改善传统牛干巴的发酵工艺并提升其价值,本文计划从牛干巴筛选降低胆固醇和降低亚硝酸盐的功能性乳酸菌,并分析其发酵性能,为其潜在工业化生产应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

以贵州省黔西南兴仁县回族牛干巴为筛选源;大肠杆菌和金黄色葡萄球菌由实验室提供。

MRS培养基,CaCO3,30% H2O2溶液,胆固醇(≥99%),胆固醇(≥95.5%)邻苯二甲醛,浓硫酸,冰乙酸,乙酸锌,对氨基苯磺酸,盐酸萘乙二胺,亚硝酸盐标准溶液,硼砂,亚铁氰化钾,牛胆盐,蔗糖八乙酸脂,脱脂乳粉,糖发酵鉴定管。

高压蒸汽灭菌锅江阴滨江医疗设备有限公司;奥林巴斯生物显微镜奥林巴斯中国有限公司;司水套式二氧化碳培养箱上海三腾仪器有限公司;紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;S-3C型pH计成都世纪方舟科技有限公司;立式超低温冰箱海尔特种电器有限公司;真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1乳酸菌的分离纯化在无菌操作条件下,将剪碎的25 g样品加入225 mL无菌蛋白胨水的三角瓶中(蛋白胨1 g/L,NaCl 0.85 g/L,吐温-80 1 mL/L),于摇床上振荡60 min,静置10 min。取上清液1 mL作10倍梯度稀释,选择合适稀释浓度涂布于CaCO3-MRS培养基平板上,37 ℃下厌氧培养48 h,挑选产生溶钙圈的单菌落,继续分离纯化。纯菌革兰氏染色后,选取革兰氏阳性菌和触酶阴性菌(直接在菌落上滴加3%～15% H2O2),镜检观察。分离至纯的菌株进行斜面接种,0～4 ℃下短期保藏,或终浓度20%的甘油-80 ℃下长期保藏。

1.2.2乳酸菌的生理特性指标通过过氧化氢酶实验、吲哚实验、石蕊牛乳实验、葡萄糖产酸产气实验、乙酰甲基甲醇实验(V-P)、明胶液化实验、乳酸定性实验以及运动性检查,并且测定菌株是否满足发酵肉制品基本条件:不产粘液,不产H2S,抑制病原菌的生长等[6]。

1.2.3乳酸菌降胆固醇能力测定乳酸菌的降胆固醇能力参考文献报道的OPA法(邻苯二甲醛法)[7]。新鲜培养的菌株按3%(v/v)接种于胆固醇含量为100 μg/mL的MRS液体培养基中,在37 ℃的二氧化碳培养箱中培养24 h后,12000 r/min,离心10 min测定上清液中胆固醇残留量。

1.2.4乳酸菌降解亚硝酸盐的能力乳酸菌降解亚硝酸盐的测定根据GB 5009.3-2010方法测定,将菌株按3%(V/V)接种于NaNO2的浓度为100 μg/mL的MRS液体培养基中,分别于0、12、24 h测定NaNO2的残留量。

1.2.5乳酸菌的耐酸、耐胆盐能力

1.2.5.1耐酸能力待测菌株在MRS液体培养基中37 ℃培养20 h,取0.3 mL的细菌培养液接种于10 mL磷酸盐缓冲液,分别用5 mol·L-1HCl调节pH至3。初始细菌浓度为106～108CFU·mL-1,置于37 ℃下培养3 h。采用平板计数法测存活菌数,并计算存活率。

存活率(%)=培养3 h后的活菌数/培养前的活菌数×100

1.2.5.2耐胆盐能力筛选菌株接种于6 mL MRS培养基中37 ℃培养20 h,将0.3 mL培养物分别接种于10 mL含胆盐0(即空白)、0.3%的MRS液体培养基,37 ℃培养24 h后,于600 nm处测定培养液的 OD值,计算菌株对不同浓度胆盐的耐受能力。

胆盐耐受力(%)=加胆盐培养基的OD值/空白培养基的OD值×100

1.2.6乳酸菌生产适应性

1.2.6.1乳酸菌的生长曲线以及产酸能力将活化好的菌种按3%(V/V)的接种量接种到MRS液体培养基中,37 ℃厌氧培养24 h,每隔2 h取样测定OD600值,并测定样液的pH。

1.2.6.2乳酸菌的耐盐、耐亚硝酸盐能力将菌种接种于添加0、2%、4%、6%、8% NaCl的MRS液体培养基,在有氧环境中37 ℃培养24 h,以不接菌的相应的NaCl浓度的MRS液体培养基作空白对照,在600 nm下测定培养液OD值,比较菌种在不同盐浓度下的生长情况。

将菌种接种于添加0、50、100、150、200 mg/kg NaNO2的MRS液体培养基,在有氧环境中37 ℃培养24 h,以空白MRS液体培养基作对照,在600 nm条件下测定OD值,比较菌株对亚硝酸盐的耐受能力。

1.2.6.3乳酸菌在不同温度下生长情况根据肉制品发酵工艺条件要求,将菌株接种于MRS液体培养基中,分别在4、15、25、35、45 ℃条件下培养24 h,于波长600 nm测定菌株生长状况,同时用pH计测定不同温度菌株产酸情况。

1.2.6.4乳酸菌抗冷冻干燥能力新鲜培养物4000 r/min离心10 min,收集菌体以10%的脱脂乳为真空冷冻干燥的保护剂混匀后分装,预冻3 h,冷冻干燥12 h,分别在不同时间段测定菌粉保藏在25 ℃和4 ℃条件下活菌数,单位log CFU/mL。

1.2.7乳酸菌的鉴定

1.2.7.1形态鉴定菌株于37 ℃二氧化碳培养箱培养24 h观测菌落特征,记录菌落边缘形状、大小、颜色,显微镜观察菌体革兰氏染色、个体形态等。

1.2.7.216S rRNA分子生物学鉴定DNA的提取:采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒,方法根据试剂盒说明书。PCR扩增:引物为27F:AGTTTGA TCMTGGCTCAG;1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,具体实验方法参照文献报道[8]。PCR产物经1%琼脂糖电泳分析后测序,所得序列在NCBI中比对,选取相似性较高的菌株的16S rRNA序列,用MEGA软件构建系统发育树。

1.2.8统计分析实验数据采用SPSS 18.0软件分析,p<0.05表示差异显著,p>0.05表示无显著差异。

2　结果与讨论

2.1菌株分离纯化以及生理特性指标

通过挑选CaCO3-MRS培养基平板上产酸能力强的菌株进一步纯化、镜检,最终保藏革兰氏阳性,过氧化氢酶阴性,吲哚实验、石蕊牛乳实验、葡萄糖产酸产气实验等满足益生乳酸菌要求,能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,且不产粘液和H2S菌株的共18株。

2.2菌株降胆固醇能力测定

将上述牛干巴中分离的菌株编号为NR1,NR2,…,NR18,通过OPA法测定其胆固醇清除能力,测定的OD550的值代入所测的标准曲线y=0.0051x-0.0009,R2=0.9988中,结果如表1所示,胆固醇清除率为7.29%～22.61%。为提高筛选效率,选择18株乳酸菌中胆固醇清除率>15%的菌株6株NR6,NR7,NR9,NR10,NR13,NR16进行后续研究。

表1　菌株胆固醇清除能力Table 1　The cholesterol reducing rate of strains

Esra Tok等[4]研究五种德氏乳杆菌在不同培养时间下胆固醇清除能力,发现19 h和48 h胆固醇清除率无显著差异(p>0.05),因此将菌株培养19 h即可,且文献报道了这五种德氏乳杆菌的胆固醇清除率为8%～26%。乳酸菌降解胆固醇的机理尚不明确,Miremadi等[9]对益生乳杆菌和双歧杆菌的降胆固醇机理进行研究,结果表明菌株对胆固醇的清除能力是由于不同原因造成,有的主要以产BSH影响,有的以同化吸收为主。汪晓辉等[10]从泡菜、传统腊肠中筛选出降胆固醇率分别为49.11%和50.03%的植物乳杆菌。

2.3菌株降解亚硝酸盐能力

腌制食品中添加亚硝酸盐能抑制肉毒杆菌的生长,抑制毒素的产生,且对发酵肉的色泽和风味起重要作用。新鲜肉中的血红素也增加癌症的风险,在胃肠道中血红素能够促进亚硝基的合成。而腌制肉中添加亚硝酸盐能提高亚硝基合成,由于这个原因,大量研究报道亚硝酸盐替代物:如蔬菜提取物(芹菜),天然抗菌剂(乳酸,细菌素,或者直接添加益生乳酸菌),以及严格控制加工过程。到目前为止,还没有找到任何一种单一的化合物能够代替亚硝酸盐在肉制品发酵过程中所起的多重作用[11]。

欧洲2006/52/EC指令规定:在干发酵香肠中硝酸盐和亚硝酸盐的最大添加量均为150 mg/kg,而长时间腌制的产品在没有添加亚硝酸盐的情况下,硝酸盐的最大添加量可以是250 mg/kg。在2007年,丹麦官方规定在沙拉米香肠中亚硝酸盐的最大使用量为100 mg/kg,又考虑到香肠发酵过程中会产生亚硝胺,2011年丹麦官方就规定欧洲所有肉制品的亚硝酸盐的最大添加量应低于100 mg/kg。

为进一步筛选目的菌株,通过盐酸萘乙二胺比色法测定胆固醇清除率大于15%的6株乳酸菌的降解亚硝酸盐能力,于波长538 nm测定OD值,测定结果代入所测标准曲线y=0.0158x-0.0011中,结果如表2所示。初始配制的MRS液体培养基中NaNO2的浓度为100 μg/mL,灭菌后测得实际值为93.797 μg/mL,亚硝酸盐的降解率按实际测定值计算。从表2中可知,菌株培养12 h时降解亚硝酸盐的能力呈显著差异(p<0.05),NR7在12 h时降解率达36.44%,降解量34.177 μg/mL。当培养24 h,菌株对亚硝酸盐的降解率除NR10和NR6以外,其余菌株无显著差异(p>0.05)均大于95%,降解量最高达89.873 μg/mL。菌株NR10降解亚硝酸盐的能力明显低于其他5株菌,因此选择NR6,NR7,NR11,NR14,NR17进行下一步研究。

2.4菌株耐酸、耐胆盐能力

2.4.1耐酸能力耐酸耐胆盐是乳酸菌作为食补因子的重要指标,益生乳酸菌随食物进入胃肠道环境,而人体胃液pH为3.0左右,空腹时可达1.5,食物在胃中停留时间大约在2～3 h,而作为益生菌必需具有较好的耐酸性[12]。由表3可知,5株实验菌株在pH为3.0的环境中处理3 h的活菌率呈显著差异(p<0.05),其中耐酸能力最强的菌株NR7,活菌率为99.50%。作为益生菌,不仅耐酸,还需具有一定耐胆盐能力。因此,进一步研究其耐胆盐能力。

表2　菌株降解亚硝酸盐能力Table 2　The nitrite degradation ability of strains

注:表中同列不同字母表示差异显著,下同。

表3　菌株耐酸能力Table 3　The tolerance of strains on acid

2.4.2耐胆盐能力人体正常的胆盐浓度是在0.03%～0.3%之间,食物通过肠道的时间一般是4～16 h[13]。因此将实验菌株在0.3%的胆盐中处理24 h,结果如图1所示,菌株NR7对0.3%的胆盐有较高的耐受性,显著(p<0.05)优于其他菌株。因此将NR7作为筛选的具有降胆固醇和降亚硝酸盐的目的菌株进行发酵特性研究。

图1　菌株在含0.3%的胆盐培养基中培养24 h后的变化Fig.1　The change of strains in medium containing 0.3% bile salt culture after 24 h

2.5菌株NR7的生产适应性

肉制品发酵剂的筛选条件:产酸快,能在15～40 ℃条件下生长,对肉制品发酵过程添加辅料(NaCl和NaNO2)具有耐受性[14]。发酵剂的制作采用真空冷冻干燥技术,因此还需具有一定抗冷冻干燥的能力,使菌株活菌率达8 log CFU/mL[15]。

2.5.1菌株发酵特性如图2中A为NR7的生长曲线和产酸特性,在6 h就开始对数生长期,12 h进入稳定期,在12 h,pH从6.5降到4.0,然后趋于稳定。B表示NR7在不同温度条件下生长状况,图中显示菌株在15～40 ℃之间均能生长,各温度下菌株的生长呈显著差异(p<0.05),且在35 ℃下生长快,产酸能力强。C表示NR7对盐的耐受性,2%的NaCl与空白对照组无显著差异(p>0.05),其不同浓度间生长状态呈显著差异(p<0.05),且菌株NR7对8%的NaCl具有较高耐受性,原因可能是筛选源含盐量高,使得其具有高耐盐性。D表示对不同浓度亚硝酸盐耐受性,可见含50 mg/kg的NaNO2实验组与空白对照组差异不显著(p>0.05),与其他浓度实验组呈显著差异(p<0.05)。而100～200 mg/kg NaNO2之间无显著差异,可能与菌株NR7降解亚硝酸盐的能力有关。

图2　菌株发酵特性Fig.2　The strain fermentation charactristics (A)生长曲线和产酸特性; (B)不同温度下生长情况以及产酸能力; (C)对盐耐受性;(D)对亚硝酸盐耐受性。

保藏条件(℃)初始活菌数(logCFU/mL)冻干后活菌数(logCFU/mL)存活率(%)5d后活菌数(logCFU/mL)存活率(%)15d活菌数(logCFU/mL)存活率(%)30d活菌数(logCFU/mL)存活率(%)259.09±0.018.51±0.0193.628.16±0.0289.777.57±0.0383.284.62±0.0850.8349.09±0.018.51±0.0193.628.42±0.0192.638.37±0.0192.088.18±0.0289.99

表5　菌株NR7的生理生化特性Table 5　Physiological and biochemical characteristics of stain NR7

注:+表示阳性反应,-表示阴性反应。

2.5.2菌株NR7抗真空冷冻干燥的能力为了方便使用,选择10%脱脂乳粉作为冻干保护剂,测定不同保藏时间,保藏条件菌株NR7抗冷冻干燥能力,实验结果如表4所示。冷冻干燥后活菌率达93.62%,随着时间延长,活菌率逐渐降低,且常温(25 ℃)降低更显著,在4 ℃条件下保藏30 d活菌率达89.99%,满足直投式发酵剂要求。Jagannath等[16]选择了脱脂乳粉作为乳酸菌菌株保护剂,将实验菌株与保护剂混合,采用真空冷冻干燥技术制备冻干菌粉,菌株冻干菌粉分别保藏在4 ℃和25 ℃条件下,乳酸菌冻干粉在4 ℃条件下保藏期限更长,文献报道结果与本实验结果一致。

2.6菌株NR7的形态以及16S rRNA分子生物学鉴定

2.6.1菌落形态及菌体形态菌株NR7在MRS琼脂平板上 37 ℃培养24 h,菌落表面光滑湿润,乳白色,100倍油镜下观察,呈革兰氏阳性杆状。菌落形态和菌体形态如图3所示。

图3　NR7菌落形态(左)和100倍油镜(右)Fig.3　NR7 puried colonies morphology(L)and 100 times the oil microscopic examination of the mirror(R)

2.6.2生理生化鉴定菌株NR7的一系列生理生化鉴定结果如表5所示。

2.6.316S rRNA鉴定结果图4表示1%琼脂糖凝胶对菌株NR7以通用引物进行的PCR扩增,获得了一条特异的、大小约为1500 bp的扩增条带,条带经纯化后测序,获得1418 bp的片段。将所测得的16S rRNA基因序列提交到NCBI,通过Blast工具在GenBank数据库中比对,选取同源性较高菌株构建系统发育树如图5所示。

图4　PCR扩增电泳图Fig.4　PCR amplification lectrophoresis

由以上的系统发育树可知,菌株NR7所在最大分支所包含菌株均为乳酸杆菌,菌株的16S rRNA序列与LactobacillusplantarumstrainCIP 103151以及LactobacillusplantarumWCF51的同源性达98%,因此菌株NR7为植物乳杆菌。

3　结论

图5　基于16S rRNA序列的NR7的系统发育树Fig.5　Systerm phylogenetic tree of NR7 based on 16S rRNA sequence

本实验选取回族传统发酵牛干巴作为乳酸菌筛选源,分离出18株乳酸菌,通过OPA法测定其降胆固醇能力,其中有6株菌株的胆固醇清除能力大于15%,为近一步筛选出目的菌株,通过盐酸萘乙二胺比色法测定其降解亚硝酸盐能力,最终5株菌在24 h降解亚硝酸盐能力大于94%。菌株要达到益生的作用,必需能够耐受pH为3.0的环境以及0.3%的胆盐,5株菌的耐酸能力均达97%以上,但菌株NR7对0.3%的胆盐耐受性最强。因此,选择NR7作为目的菌株,进一步研究其生产适应性,发酵4 h使pH迅速降低,在15～40 ℃环境条件下生长,耐受8%的NaCl和200 mg/kg的NaNO2,且真空冷冻干燥后活菌率93.62%,4 ℃条件下保藏30 d后活菌率可达89.99%。可见,菌株NR7满足发酵肉制品发酵剂的条件。16S rRNA分子生物学鉴定,菌株NR7为植物乳杆菌。

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Isolation and screening of lactic acid bacteria with the ability to remove cholesterol and lower nitrite from cured beef and its fermentation performances

SONG Xiao-juan1,2,HE La-ping1,2,3,*,LI Cui-qin4,ZHU Qiu-jin1,2,FAN Jin1

(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store & Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Pork products Research Center of Engineering Technology,Guiyang 550025,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

18 strains of lactic acid bacteria were isolated from traditional fermented cured beef.The o-phthalaldehyde method was used to determine the amount of cholesterol,the rate of cholesterol-degrading of strain NR7 was 22.61%.The N-(1-Naphthyl)-ethyl-enediamine dihydrochloride method was used to determine the amount of nitrite,after inoculating 12 h and 24 h,the amount of degeneration of nitrite were 34.177 μg/mL and 95.82 μg/mL,respectively.In the pH3.0 environment,the viable bacteria rate of NR7 was 99.50% and able to tolerate 0.3% bile salts. Therefore,NR7 strain was selected as the target strain,and the production adaptability had to be further researched.After inoculating 4 h,it can produce acid quickly.It can also grow under 15～40 ℃,and be able to tolerate 8% NaCl and 200 mg/kg NaNO2.After the vacuum freeze drying,the rate of survival live was 93.62%. After preserving 30 d at 4 ℃,the survival rate of bacteria was 89.99%.The NR7 strain was identified asLactobacillusplantarumby 16S rRNA sequencing.

cured beef;cholesterol;nitrite;Lactobacillusplantarum;fermentation performance

2015-10-16

宋小娟(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:juanxiaosong1029@163.com。

何腊平(1972-)，男，博士,教授，研究方向：发酵工程/生物催化与生物转化，E-mail:helaping@163.com。

国家自然科学基金(31160002)；贵州省猪肉制品工程技术研究中心项目(黔科合农G字[2013]4001号)；贵州省重大专项项目：贵州省猪肉特色制品深加工关键技术研究及产业化示范(黔科合作重大专项字[2015]6004号)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0159-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.023