响应面优化超声波提取油松花粉多酚的工艺研究

范三红,秦婉宁,李　静,陈　超,杜静婷

(山西大学生命科学学院,山西太原 030001)



响应面优化超声波提取油松花粉多酚的工艺研究

范三红,秦婉宁,李静,陈超,杜静婷

(山西大学生命科学学院,山西太原 030001)

研究了油松花粉多酚的超声波辅助提取工艺。在单因素实验结果的基础之上,通过Plackett-Burman筛选,确定出提取温度、料液比和提取时间为显著影响因子,选用3因素3水平的响应面分析法来优化油松花粉多酚的提取工艺。依据数据进行模型拟合和回归分析,确定影响油松花粉总酚得率的重要因素为提取时间和料液比,得出油松花粉多酚的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数80%、料液比1∶32 g/mL、提取时间为31 min、提取温度为51℃,在此工艺下总酚含量可达6.735mg/g。实验结果显示,超声波辅助提取有效地优化了油松花粉多酚的提取条件,为其开发利用提供了理论支持。

油松花粉,多酚,提取,响应面

油松是我国资源丰富的特有树种,其花粉量大,花粉颜色呈鲜黄色或淡黄色,形状为粉状颗粒。油松花粉含有大量的多糖、脂肪酸、黄酮、矿物质和氨基酸,被称作“微型营养库”[1]。油松花粉的应用历史久远,《神农本草经》把它视作上等药,书中道长期服用可强身延年,它还可延缓衰老、抗疲劳、降血脂、增强人体免疫力,是一种具备药用价值的天然食品材料。

长期的研究结果证明,多酚有较强的抗氧化能力,它能够预防发生心血管疾病,还可以抗癌、抑菌消炎、提高人体免疫力[2]。根据对油松花粉中多酚的最佳提取工艺研究,可以总结出油松花粉在储存过程中多酚含量的变化情况,为其储存提供理论依据。

超声波能够产生机械振动,并具有强烈的空化效应和热效应,能够破坏细胞结构,从而加速目标成分的溶出,不仅能缩短提取时间还同时避免了高温对有效成分的破坏[3]。龚明贵等[4]提取油菜蜂花粉多酚利用的是超声波辅助法,得率达16.25mg/g。本研究利用超声波辅助乙醇浸提法提取油松花粉多酚,优化了油松花粉多酚的提取条件,可有效提高多酚得率,缩短提取时间,节约生产成本,提高产物质量,为日后油松花粉的开发利用及其多酚的大量提取提供了参考依据,并为多酚抗氧化等功能性质的深入研究奠定了理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

油松花粉山西省安泽县惠原科贸有限责任公司;Folin-Ciocalteu试剂、没食子酸、无水碳酸钠、无水乙醇上述试剂均为分析纯。

TG16A-WS型高速离心机武汉爱斯佩科学仪器有限公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司;JP-040ST型超声波清洗机深圳市洁盟清洗设备有限公司;JA1203N型电子分析天平上海精密科学仪器有限公司;SP-2000UV型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1油松花粉预处理采用温差-超声波复合破壁法[5],将冷冻后的灭菌花粉迅速置于热水中搅拌,冷却至室温后用功率为240 W的超声波处理10 min,最后在电热鼓风干燥箱内干燥后得破壁花粉。

1.2.2油松花粉多酚提取流程破壁后的油松花粉加入乙醇→超声波浸提→3000 r/min、5 min离心分离→取上清液→加入Folin-Ciocalteu试剂→摇匀后加入20%Na2CO3溶液→蒸馏水定容至20 mL→避光反应1 h[6]。

1.2.3单因素实验设计采用控制变量法[7],分别研究乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间这四个因子对油松花粉多酚得率的影响。

1.2.3.1乙醇体积分数对油松花粉多酚得率的影响将料液比定为1∶20 g/mL,提取温度40℃,提取时间30 min,分别在乙醇体积分数为0%、20%、40%、60%、80%、100%下研究乙醇体积分数对油松花粉多酚得率的影响。

1.2.3.2料液比对油松花粉多酚得率的影响将乙醇体积分数定为60%,提取温度40℃,提取时间30 min,分别在料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL下探究料液比对油松花粉多酚得率的影响。

1.2.3.3提取时间对油松花粉多酚得率的影响将料液比为1∶20 g/mL,乙醇体积分数60%,提取温度40℃,分别在提取时间为10、20、30、40、50、60 min下研究提取时间对油松花粉多酚得率的影响。

1.2.3.4提取温度对油松花粉多酚得率的影响将料液比定为1∶20 g/mL,乙醇体积分数60%,提取时间30 min,分别在提取温度为30、40、50、60、70、80℃下研究提取温度对油松花粉多酚得率的影响。

1.2.4Plackett-Burman筛选实验设计在单因素实验基础上进行PB实验,应用 Minitab15.1对乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间这4个单因素进行N=12PB设计及分析,以油松花粉总酚含量为指标,实验设计及结果见表3。

1.2.5响应曲面实验设计通过单因素实验的结果,选择提取温度、料液比和提取时间为3个考察因素,采用Box-Behnken进行实验,对数据进行回归分析后建立二次响应回归模型,拟合得到二次回归方程。

表1　Plackett-Burman实验设计因素水平表

表2　Box-Behnken实验设计因素水平表

1.3油松花粉总酚含量的测定

选Folin-Ciocalteu法测定总酚的含量[8],用没食子酸作为标品来制作标曲,得到吸光度与总酚质量浓度的方程为:y=0.0563x+0.0659(R2=0.9996)

取1 mL油松花粉提取液加入20 mL试管中,依次加入Folin-Ciocalteu试剂0.2 mL,20%Na2CO3溶液2 mL,用蒸馏水来定容,室温避光反应1 h,于765 nm下测定吸光度,将其代入标曲中,计算得式样中总酚浓度,并计算油松花粉中总酚的含量。

式中:c为试管中油松花粉总酚浓度(μg/mL);v1为试管量程(20 mL);v2为反应体系中油松花粉提取液体积(1 mL);v为总酚提取液总体积(mL);m为油松花粉质量(g)。

1.4统计分析

所有实验重复测定3次,各项指标的数据均用Origin 8.5软件处理作图,利用Minitab15.1进行方差分析。

2　结果与分析

2.1单因素实验结果分析

2.1.1乙醇体积分数对油松花粉多酚得率的影响通过图1可知,油松花粉多酚得率随乙醇体积分数的增大先增大后急剧减小。这大概是由于当乙醇体积分数较低时,多酚和蛋白质、多糖等之间的疏水作用力及氢键会随着乙醇体积分数的增大而更易断裂,使得多酚得率变大[9]。但乙醇体积分数大于80%后,可能是由于油松花粉多酚水溶性较弱,醇溶性较强,由相似相溶原理可知,多酚得率开始下降[10]。综合考虑,确定最适乙醇体积分数为80%。

图1　乙醇体积分数对油松花粉多酚得率的影响Fig.1　Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.2料液比对油松花粉多酚得率的影响通过图2可知,油松花粉多酚得率随料液比的减小先增大后减小。这可能是由于溶剂和样品比例越大,浓度差则越大,进而加快了传质的过程,但当料液比小于1∶30 g/mL时,超声波的效应不再显著,使得多酚得率不增加甚至降低[11],因此确定料液比1∶30 g/mL为宜。

图2　料液比对油松花粉多酚得率的影响Fig.2　Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.3提取时间对油松花粉多酚得率的影响通过图3可知,油松花粉多酚得率随提取时间增加先增大后减小,且当提取时间是30 min时达到最大值。这可能是因为提取时间较短时,超声波的作用强度不够,而油松花粉细胞破裂、多酚物质的溶出需要一定的时间,多酚随时间的增加能被充分提取,但当时间过长,多酚物质可能会被超声波产生的巨大机械能所破坏[12],从而使得得率降低,因此确定最适提取时间是30 min。

图3　提取时间对油松花粉多酚得率的影响Fig.3　Effect of extraction time on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.4提取温度对油松花粉多酚得率的影响通过图4可知,油松花粉多酚得率随提取温度的升高先增大后减小。当温度较小时,多酚溶解不充分,而随着温度升高,油松花粉多酚的溶出率也逐渐增大,当温度达到一定程度后,溶剂挥发过多及温度过高导致油松花粉多酚的增加率与其损失率基本接近时[13],油松花粉多酚的得率将开始下降,故而确定最适温度为60℃。

图4　提取温度对油松花粉多酚得率的影响Fig.4　Effect of extraction temperature on the yiled of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.2Plackett-Burman筛选实验结果分析

2.2.1PB实验设计及结果

表3　PB实验设计及结果

2.2.2方差分析及显著因子的确定应用Minitab15.1进行方差分析,结果见表4。

表4　方差分析表

表5　回归系数及显著性检验

注:**表示差异极显著(p<0.01);*表示差异显著(p<0.05)。

由表5可得知,影响因子显著性依次为C>A>D>B,其中A、C、D三个因子p<0.05,说明具有显著性。因此,在乙醇体积分数为80%的条件下,选取提取温度、料液比、提取时间为显著因子来做响应面分析,从而确定最优组合。

2.3响应面优化油松花粉多酚提取工艺结果分析

2.3.1响应面设计及结果分析

表6　响应面实验设计及结果

运用Minitab15.0对表中的实验数据进行线性拟合,获得编码空间的三元二次方程如下表示:

Y=6.745+0.106375A+0.586B+0.164125C-0.937375A2-0.827625B2-0.372375C2-0.115AB+0.07025AC-0.2575BC

对上述模型采取回归分析,分析结果见表7。

表7　回归方程方差分析

表8　回归系数显著性分析

从回归系数显著性分析表可见,实验中常量、B、A2、B2、C2这五个因素对油松花粉多酚提取的影响是极显著的,而A、C、BC这三个因素对油松花粉多酚提取有显著性影响,说明料液比对多酚提取有极显著影响,而提取温度和提取时间对其有显著影响,也说明提取温度、料液比和提取时间对其的影响是非线性的。

2.3.2响应面分析与优化曲面图能够反映出多酚含量的大小,通过图5可知当提取温度在44～56℃,料液比在1∶29～1∶35 g/mL时,多酚含量存在最大值。通过图6可知当提取温度在43～54℃,提取时间在27～38 min时,多酚含量存在最大值。通过图7可知料液比在1∶28.5～1∶35 g/mL,提取时间在22～40 min时,多酚含量存在最大值。

图5　提取温度和料液比交互影响多酚含量的响应面图Fig.5　Extraction temperature and liquid ratio interaction response surface figure of the polyphenol content

图6　提取温度和提取时间交互影响多酚含量的响应面图Fig.6　Extraction temperature and extraction time interaction response surface figure of the polyphenol content

图7　料液比和提取时间交互影响多酚含量的响应面图Fig.7　Liquid ratio and extraction time interaction response surface figure of the polyphenol content

采用Minitab15.1的响应优化器来优化预测油松花粉多酚的提取工艺条件,得出最佳的工艺条件是:提取温度为50.5℃,料液比为1∶31.5 g/mL,提取时间为31 min,此时多酚含量最大为6.854mg/g。

2.4油松花粉多酚提取工艺条件验证实验

为了进一步验证响应面实验结论的准确性,兼顾到实验操作的可行性,对预测的最佳实验条件进行修正:提取温度为51℃,料液比为1∶32 g/mL,提取时间为31 min,按照此优化条件对油松花粉多酚进行提取,实验重复三次并取平均值为6.735mg/g,与理论值相比误差为1.74%,说明所得参数可靠,能较好的预测油松花粉多酚的实际含量,具有很好的应用价值。

3　结论

以单因素实验结果为基础,使用Minitab15.1软件优化超声波辅助提取油松花粉多酚的工艺,结合实验操作的可行性确定最佳实验条件为提取温度51℃,料液比1∶32 g/mL,提取时间31 min,在此条件下油松花粉多酚含量达6.735mg/g。

目前国内外对油松花粉的研究利用较少,优化油松花粉多酚提取工艺对多酚提取的关键共性技术有理论与实际应用的指导意义,对开发花粉类、多酚类保健食品和药品,提高花粉资源利用率和精加工提供一定的技术指导,也为日后油松花粉多酚的进一步分离鉴定及功能性研究奠定了基础。

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Optimization of ultrasonic extraction of polyphenlos from the pollen of Pinus tabulaeformis by response surface

FAN San-hong,QIN Wan-ning,LI Jing,CHEN Chao,DU Jing-ting

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030001,China)

The ultrasonic extraction process of Pinus tabulaeformis pollen polyphenols were studied.Based on the results of single factor experiment,through the Plackett-Burman selection,extraction temperature,liquid ratio and extraction time were determined the significant impact factors,three factors three levels of response surface analysis was chosen to optimize the extraction process of Pinus tabulaeformis pollen polyphenols.According to the model fitting and regression analysis of experiment data,liquid ratio and extraction time were determined the two significant factors which influence the total phenol yield of the Pinus tabulaeformis pollen,it was concluded that the optimal extraction conditions were ethanol volume fraction 80%,liquid ratio 1∶32 g/mL,extraction time 31 minutes and extraction temperature 51℃.Under the conditions,the yield of total phenols from Pinus tabulaeformis pollen can be up to 6.735mg/g.The results showed that the extraction process conditions were optimized effectively by the ultrasonic,providing theoretical support for the development and utilization of Pinus tabulaeformis pollen.

Pine pollen;polyphenols;extraction;response surface

2015-09-24

范三红(1963-)，男，硕士，副教授，研究方向：食品科学，E-mail:fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科学基金项目(2012011031-4)；山西省高等学校高新技术产业化项目(20111003)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)07-0215-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.033