高糖食品中2(4甲氧基苯氧基)丙酸钠的风险评估

崔海萍,周　佺,吴炜亮,*,卢　姗,黄翠莉,何春林,李晓明,龙顺荣

(1.国家食品质量监督检验中心(广东)广东产品质量监督检验研究院,广东佛山 528300;2.广州市食品药品监督管理局审评认证中心,广东广州 510030;3.广东省肇庆市食品药品检验所,广东肇庆 526060)



崔海萍1,周佺2,吴炜亮1,*,卢姗1,黄翠莉1,何春林3,李晓明1,龙顺荣1

(1.国家食品质量监督检验中心(广东)广东产品质量监督检验研究院,广东佛山 528300;2.广州市食品药品监督管理局审评认证中心,广东广州 510030;3.广东省肇庆市食品药品检验所,广东肇庆 526060)

为探讨化学合成的芳氧羧酸类化合物2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠在食品生产中作为食品添加剂的安全性,本文采用动物实验对化学合成的2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠进行毒理学评价,采用高效液相色谱法对食品中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的使用率进行研究。毒理学实验结果表明,化学合成的2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的半数致死量LD50为6577 mg/kg bw,哺乳动物微粒体酶实验及小鼠精子畸形实验分别显示其未见明显的致突变性及遗传毒性。色谱检测结果表明,月饼、糖果及糕点等3类高糖食品的2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠使用率较高,其中平均使用量分别为149.48±1.26、52.30±1.87、71.31±1.39 mg/kg;中位值使用量分别为118.05±2.11、72.58±0.94、(65.77±1.02) mg/kg;95%位值使用量分别为439.97±2.06、340.77±1.45、137.63±1.62 mg/kg。综合毒理学评价结果及2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的使用情况进行风险评估,结果表明添加量为95%位值使用量时,化学合成的2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠暴露量已超出其ADI值,可能会对高糖食品的安全性造成影响。

高糖食品,芳氧羧酸类化合物,2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠,风险评估

芳氧羧酸类化合物2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠(PMP)是咖啡豆中的一种微量天然次生代谢产物,因其具有抑制甜味的神奇效果而被视为具有潜在市场价值的食品添加剂。经过一系列安全性评价后,PMP被我国食品安全国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》允许作为天然等同香料使用,因此未规定其使用量,而实际使用过程中其具有抑制甜味的效果,以达到改善食品感官品质的目的[1-6]。由于天然的PMP提纯成本昂贵而无法商业化生产,因此目前市场上普遍使用化学合成的2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠(CPMP)进行替代,但其中残留的原料及副产物等杂质有可能影响食品的安全,为了保障CPMP在食品中的使用安全,有必要对其进行风险评估,并根据评估结果设定相应的使用范围、使用量及检测方法等标准规范。检测食品中PMP的含量可使用气相色谱法或高效液相色谱法,使用气相色谱法检测时需要将其衍生化为酯才可对其进行定量测定,而使用高效液相色谱法,仅需对食品进行简单的前处理后即可上机检测,具有高效、灵敏度高,重现性好等特点。据此,本论文旨在使用高效液相色谱法[8]对CPMP的可能使用范围及使用量进行系统研究,并通过动物实验数据对其进行风险评估及危害分析,为研究并制订高糖食品中CPMP的使用范围及使用限量标准提供数据支撑,以规范新型食品添加剂CPMP在食品中的使用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

昆明小鼠(雄性55只,雌性30只),体重18～22 g;离乳Wistar大鼠(雄性42只,雌性40只),体重90～100 g SPF级广东省医学实验动物中心;食品样品 采集自流通环节或生产环节(各类食品样品的批次数见表1及表2);CPMP 98%河源华益食品科技有限公司;甲醇,乙腈,色谱纯德国CNW公司;磷酸,亚铁氰化钾,分析纯天津市永大化学试剂有限公司;乙酸锌,分析纯天津市天力化学试剂有限公司;水合氯醛,分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司;2,4,6-三硝基苯酚(苦味酸),分析纯广州化学试剂厂;氯化钠,分析纯上海强顺化学试剂有限公司;10%中性福尔马林固定液北京市益利精细化学品有限公司;无水乙醇,95%乙醇,二甲苯,分析纯广州市中南化学试剂有限公司;敌克松,1,8-二羟蒽醌百灵威科技有限公司;叠氮钠江苏晶美生物科技有限公司;2-氨基芴上海抚生生物技术有限公司;环磷酰胺江苏恒瑞医药有限公司;鼠伤寒沙门菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102广东出入境检验检疫技术中心;血液生化试剂盒生化试剂上海复星长征医学科学有限公司;超纯水18.2 MΩ·cm自制;CPMP标准品,纯度98%美国Sigma-Aldrich公司。

Shimadzu LC 20A液相色谱仪日本Shimadzu公司;雷磁PHS-3C pH计上海市仪电科学仪器股份有限公司;Sigma 3-18K冷冻离心机德国Sigma公司;Barnstead超纯水机美国Thermo Scientific公司;自动染色机Microm HMS美国Thermo公司;Microm EC350-1石蜡包埋机美国Thermo公司;Microm EC350-2组织切片机美国Thermo公司;BX51高级研究型正立荧光显微镜+相差摄像系统日本Olympus公司;GHP-9160 隔水式恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司。

表1　调查CPMP使用量时所采集的食品样品列表

表2　用于研究高糖食品中CPMP使用量的食品样品列表

1.2实验方法

1.2.1急性毒性实验根据国家标准GB 15193.3-2003急性毒性实验,选取60只体重为30～40 g的昆明小鼠,雌雄各半,随机分为6组,每组5只小鼠。在绝对致死质量浓度和最大耐受质量浓度之间确定组间剂量比,并配制相应浓度的受试物溶液,按每组设定剂量对小鼠进行灌胃,连续观察14 d(自由摄取饲料及水),记录各组小鼠体重、中毒症状和死亡情况,最后采用改良寇氏法计算受试物CPMP的LD50值。

1.2.2哺乳动物微粒体酶实验(Ames实验)根据国家标准GB 15193.4-2003鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶实验,采用常规平板掺入法将受试物CPMP接入培养基,剂量分别为5000、1000、200、40、8 μg/皿。由于本实验的受试物采用蒸馏水溶解,因此不重复增设溶剂对照组,阴性对照组的蒸馏水剂量为0.1 mL/皿。阳性对照组试剂采用敌克松、叠氮钠、2-氨基芴和1,8-二羟蒽醌,剂量分别为50.0、1.5、10.0、50.0 μg/皿,在加与不加S9混合物情况下采用平板掺入法进行实验,每个剂量重复3次,记录每皿回复突变菌落数。若受试物的回变菌落数超过自发回变数的2倍或以上,并具有剂量—反应关系者,即为实验结果阳性。

1.2.3小鼠精子畸形实验根据国家标准GB 15193.7-2003 小鼠精子畸形实验,选取雄性昆明小鼠25只,随机分为5组,分别为阴性对照组(蒸馏水)、实验组(CPMP剂量分别为3000、1500、800 mg/kg bw)、阳性对照组(环磷酰胺,40 mg/kg bw),每组5只小鼠。实验开始前,对所有组别动物禁食6 h,之后按0.4 mL/20 g bw经口灌胃,每天1次,连续5 d。每组小鼠给予全价饲料,自由饮水。实验小鼠于首次染毒后的第35 d称重后用颈椎脱臼法处死,对双侧副睾制片镜检,记录精子畸形数并统计畸形率,采用秩和检验统计处理。如实验组的精子畸形率比正常对照组增加,并有明显的统计学意义,即为结果阳性。

1.2.430 d喂养实验根据国家标准GB 15193.13-2003 30 d和90 d喂养实验,选取80只离乳Wistar大鼠,使用AIN-93G饲料对其进行适应性喂养1周。然后,按体重将大鼠随机分成4组,每组雄鼠及雌鼠各10只,分别为阴性对照组,喂饲AIN-93G饲料;实验1组,喂饲20 g/kg CPMP的饲料;实验2组,喂饲30 g/kg CPMP的饲料;实验3组,喂饲60 g/kg CPMP的饲料。阴性对照组及实验组大鼠均单笼饲养,实验期间各组大鼠自由摄食及饮水。分别在0、3、7、10、13、17、20、23、27、30 d记录阴性对照组和实验组大鼠的饲料食用量及体重。第30日,大鼠禁食24 h后腹腔静脉取血并摘取完整的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸及卵巢。血液样品完成血液学测定后,4000 r/min离心10 min,取上层血浆用于血液生化指标分析。

1.2.5液相色谱法测定食品中的CPMP

1.2.5.1标准溶液的配制(1)标准储备溶液(10.0 mg/mL)的配制:准确称取1.12 g标准品于50 mL烧杯中,加入一定量超纯水,超声振荡溶解10 min后,将其移入100 mL容量瓶中,使用少量超纯水淋洗烧杯5次,并将淋洗液转移至容量瓶,定容至刻度,摇匀,配制成浓度为10.0 mg/mL的标准储备液。(2)标准中间溶液的配制(1 mg/mL):准确吸取5 mL标准储备溶液于50 mL容量瓶中,超纯水定容至刻度,摇匀,配制成浓度为1.0 mg/mL的标准中间溶液。(3)标准使用溶液的配制:分别准确吸取不同体积的标准中间溶液于不同的50 mL容量瓶中,超纯水定容至刻度,摇匀,经0.45 μm水相微孔滤膜过滤,配制成不同浓度的标准使用溶液。

1.2.5.2样品的前处理准确称取2.50 g捣碎样品于100 mL比色管中,加适量超纯水溶解并混匀后,涡旋振荡10 min,静置30 min,分别加入5 mL亚铁氰化钾溶液(10.6%,w/w)及5 mL乙酸锌溶液(21.9%,w/w)后,超纯水定容至刻度,涡旋混匀,静置60 min后,过滤并将滤液转移至50 mL离心管中,3000 r/min离心10 min,取上清液,经0.45 μm水相微孔滤膜过滤后置于进样瓶,使用液相色谱仪对其进行定性定量检测。

1.2.5.3样品的分析测定样品中的CPMP经提取、净化后,使用液相色谱仪二极管阵列检测器检测,外标法对其进行定性、定量。液相色谱的条件:色谱柱:C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm,德国DIKMA公司);流动相:甲醇∶乙腈∶水=50∶10∶40(v/v/v,磷酸调节流动相至pH3);流速:0.8 mL/min;检测器:二极管阵列检测器(DAD);检测波长:224 nm;柱温:25℃;进样量:20 μL。

1.2.5.4CPMP含量计算根据1.3.5.3的液相色谱条件对样品进行测定,以保留时间定性,外标法定量,样品中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的含量按式(1)计算:

式(1)

其中,X为样品中CPMP的含量,mg/kg;C为样品溶液中CPMP的浓度,μg/mL;v为样品溶液定容体积,mL;m为样品质量,g;f为稀释倍数。

1.3人群CPMP暴露量评估

预算法是一种常用的食品添加剂膳食暴露量评估计算模型,通过将使用食品添加剂的食品分为固体食品和饮料2大类,并根据人体对其的最大生理消费量、食品添加剂的最大使用量、每日摄入的含有被评价食品添加剂的固体食品和饮料所占摄入的总固体食品和总饮料的比例,计算食品添加剂的每日理论最大暴露量,与食品添加剂的ADI值比较[10-12]。计算公式如式(2)所示:

M=m1×c1×R1+m2×c2×R2

式(2)

式中,M为食品添加剂的每日理论最大暴露量(mg/kg bw);m1为饮料中食品添加剂的最大使用量(mg/L);c1为每日饮料的最大生理消费量(L/kg bw);R1为含有食品添加剂的饮料占总饮料的比例(%);m2为固体食品中食品添加剂的最大使用量(mg/kg);c2为每日固体食品的最大生理消费量(kg/kg bw);R2为含有食品添加剂的固体食品占总固体食品的比例(%)。

1.4数据分析

实验数据使用PASW Statistics 18.0进行统计学分析。

2　结果与讨论

2.1急性毒性实验

隔夜空腹后,根据已设定的组间剂量经口对各剂量组小鼠进行灌胃,并观察动物的中毒症状。在受试物CPMP作用1～4 h后,低剂量组500、1000及2500 mg/kg小鼠未出现GB 15193.3-2003中所述的中毒症状,而高剂量组5000、7500、10000 mg/kg小鼠则出现不同程度的中毒症状,且动物的死亡数随着受试物剂量的增加而增加。小鼠死亡多发生在灌胃后的2～16 h内。对死亡小鼠进行解剖发现,小鼠出现胃鼓气、肝脏充血等异常,而其它脏器则未见明显异常。根据GB 15193.3-2003,选择寇氏法计算CPMP的LD50值,得出的结果为6577 mg/kg bw。根据急性毒性剂量分级表可知,CPMP为实际无毒物质。

表3　Ames实验结果

注:*表示阳性对照组与剂量组、阴性对照组比较,在0.05显著性水平上显著(p<0.05)。

表4　CPMP对小鼠精子畸形率的影响

注:*表示阳性对照组与剂量组、阴性对照组比较,在0.05显著性水平上显著(p<0.05)。2.2Ames实验

由Ames实验结果(表3)可知,不同剂量CPMP对TA97、TA98、TA100和 TA102四株菌株的回复突变菌落数均在正常值范围内。与阴性对照组的回复突变细菌数相比较,各剂量组未代谢活化或代谢活化的回复突变菌落数均小于其值的2倍,并且未见剂量—反应关系。各阳性对照组均显示强烈的诱变作用,各剂量组的回复突变菌落数与阳性对照组的回复突变菌落数存在显著的差异性(p<0.05)。上述的Ames实验结果表明,CPMP未见致突变性。

2.3小鼠精子畸形实验

小鼠精子畸形实验结果如表4所示,各组小鼠的精子均出现一定数量的畸形细胞。实验组三个剂量的小鼠精子畸形率在3.14%～3.36%之间,略高于阴性对照组小鼠的精子畸形率(2.90%),但组别之间的差异均不显著(p>0.05),而与阳性对照组小鼠的精子畸形率相比较,实验组小鼠的精子畸形率显著降低(p<0.05)。上述结果表明CPMP对小鼠精子无明显的遗传毒性。

2.430 d喂养实验

喂养实验主要是用于评价对健康造成危害的化学、生物和物理因素对动物引起的有害效应。由30 d喂养实验结果可知,实验组大鼠的体重增加随饲料中CPMP的增加而下降,尤其是实验组雄性大鼠,表明CPMP因影响大鼠的食物利用率而造成实验组大鼠体重增重的下降。与阴性对照组大鼠相比较,实验组大鼠的血液学指标及血液生化指标出现一定的负偏离,但不存在显著性差异(p>0.05),且剂量间不存在明显的剂量—效应关系。对阴性对照组和实验组大鼠的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸(卵巢)进行镜检,未发现动物的脏器发生有意义的病理改变。

2.5食品样品中CPMP的含量

采用1.3.5.2的方法对400批次采自生产环节或流通环节的各类食品进行前处理,并使用1.3.5.3的分析方法对样品中的CPMP含量进行定性定量分析,结果发现月饼、糖果、糕点等3类高糖食品中较为普遍地使用CPMP作为甜味抑制剂用于降低产品的甜味,因此针对3类高糖食品再于生产环节或流通环节各采集150批次样品,对CPMP的使用率及使用量进行研究。图1～图3分别为月饼、糖果、糕点3类产品中检出CPMP的液相色谱图,其保留时间在6.446～6.595 min之间，图4为CPMP的标准液相谱图。通过对3类食品样品的检测发现,107批次月饼样品、86批次糖果样品及62批次糕点样品检出CPMP,检出率分别为71.33%、57.33%及41.33%。采用PASW Statistics 18.0统计软件对检测数据进行分析,分别得到月饼、糖果、糕点3类产品中CPMP含量的平均值、中位值及95%位值,如表5所示。

图1　月饼中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的液相色谱图Fig.1　The LC chromatogram of sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate in mooncake

图2　糖果中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的液相色谱图Fig.2　The LC chromatogram of sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate in candy

图3　糕点中2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的液相色谱图Fig.3　The LC chromatogram of sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate in pastry

图4　2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的标准液相图谱Fig.4　The standard LC chromatogram of sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate

表5　月饼、糖果、糕点3类产品中CPMP含量的平均值、中位值及95%位值

2.6CPMP的风险评估

2.6.1危害识别CPMP,其分子式为C10H11O4Na,为无色或呈淡奶油色的晶状固体,化学结构式见图5。CPMP是在碱性环境下,通过甲氧基苯酚与2-氯丙酸反应而制备得到的,并在酸性环境下通过结晶提纯。然而,提纯后的CPMP(纯度:98%)仍含有微量的副产物及原料,当其作为食品添加剂加入食品时则有可能影响食品的安全性。

图5　2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸钠的化学结构式Fig.5　The chemical structure of sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate

对CPMP进行初步的毒理学评价发现,CPMP的经口LD50为6577 mg/kg bw,与国外急性毒性动物实验的数据(大于5000 mg/kg)相近[9-10]。进一步对CPMP的致癌性、致突变性进行评估,Ames实验结果表明CPMP无明显致癌性及致突变性,与其他致癌、致突变实验的实验结果相似,如骨髓嗜多染红细胞微核、芽孢重组修复实验等[8-9]。小鼠精子畸形实验结果则表明,CPMP无明显的遗传毒性。

2.6.2危害特征描述为了得到慢性影响的剂量阈值,采用重复剂量喂饲法对实验动物进行慢性毒性实验。在一组为期90 d的动物实验中,大鼠被暴露于0、5000、10000、20000 mg/kg四个剂量浓度的CPMP饮食中,研究大鼠的毒性临床反应、体重、血液和尿液理化指标,最终确定其无可见有害作用水平(NOAEL)为250 mg/(kg bw·day)[9-10]。选择NOAEL值作为风险评估中的参考剂量,选择100的安全系数,由此可得:每日允许摄入量(ADI)=NOAEL/100=2.5 mg/kg bw。

2.6.3暴露评估一般地,普通消费者每日消耗固体食品和饮料的平均最大生理限量分别为0.05 kg/kg bw及0.1 L/kg bw。此外,欧洲在对食品添加剂进行评估时,一般将含有评价物质的固体食品和饮料占总固体食品和饮料的比例分别设定为12.5%和25%,若该食品添加剂使用范围较广,固体食品的比例可设定为25%[11-13]。

在本研究中,对40批次饮料中的CPMP含量进行定性定量检测的结果表明,40批次饮料中均未检出CPMP,提示该食品添加剂暂未普遍应用于饮料中,因此假设暴露量计算模型中饮料部分的值为零。此外,CPMP的使用范围仅限于高糖食品,范围较窄,因此将固体食品中含有该食品添加剂的固体食品占总固体食品的比例设定为12.5%。由表5可知,CPMP在月饼中的使用量远高于其他两类食品的使用量。因此,选用CPMP在月饼中的使用量为固体食品中该添加剂的最大使用量,并将其代入暴露量计算模型中进行计算,结果见表6。

表6　高糖食品中CPMP的暴露量

2.6.4风险特征描述将高糖食品中CPMP的暴露评估结果与其每日ADI值(2.5 mg/kg bw)比较,提示当高糖食品中CPMP的添加量达95%位值或以上时,消费者对CPMP暴露量已略高于CPMP的ADI值,说明可能对高糖食品的安全性造成一定的风险,然而由于高糖食品在实际消费中尚未达到模型所设定的最大消费量,因此可能造成的风险较小,但相关食品监管部门及食品检测部门不应忽视风险的存在,应加强对CPMP的监管,包括规定其使用量及制定相应的检测方法标准。

3　结论

本研究对食品中CPMP的使用情况及高糖食品中CPMP的使用量进行调查,并在此基础上对CPMP在高糖食品中的使用量所可能产生的影响进行了评估。结果表明,在高糖食品中CPMP暴露量的中位值及平均值均远低于CPMP的ADI值,提示从总体情况看CPMP在高糖食品中的使用量不会对消费者的健康造成负面作用。然而,CPMP暴露量的95%位值已超出其ADI值,表明CPMP在高糖食品中过量使用,可能会对少部分消费者的健康构成风险。根据此研究结果,建议食品监管部门及标准制修订部门密切关注CPMP在高糖食品中的使用情况,通过风险监测等手段对CPMP的使用范围及使用量进行调查及风险评估,并在此基础上设定CPMP的使用限量及制定相应的检测方法标准,从而规范CPMP在高糖食品中的使用。

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Risk assessment for the sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy) propanoate in high sugar food

CUI Hai-ping1,ZHOU Quan2,WU Wei-liang1,*,LU Shan1,HUANG Cui-li1,HE Chun-lin3,LI Xiao-ming1,LONG Shun-rong1

(1.National Testing Center of Food Quality Supervision(Guangdong), Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision,Foshan 528300,China; 2.Guangzhou Technical Service Center for Food and Drug Inspection and Reviewing & Licensing,Guangzhou 510030,China; 3.Zhaoqing Institute For Food And Drug Control,Zhaoqing 526060,China)

To investigate the safety of chemical synthesized aryloxycarboxylic acid-sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate(CPMP)in food manufacture as food additive,the toxicological evaluation of CPMP was studied by employing animal tests and the utilization investigation was preceded using high performance liquid chromatography.The toxicological results indicated that the LD50of CPMP was 6577 mg/kg bw,and the Ames test and the mice sperm abnormality test were separately demonstrated that the CPMP had no significant mutagenicity and genetic toxicity.The detection results of HPLC showed that CPMP was applied frequently in mooncakes,candies and pastries,the average additive quantities were 149.48±1.26,52.30±1.87,71.31±1.39 mg/kg,respectively,the median additive quantities were 118.05±2.11,72.58±0.94,65.77±1.02 mg/kg,respectively;the 95% additive quantities were 439.97±2.06,340.77±1.45,137.63±1.62 mg/kg,respectively.The risk assessment of CPMP result suggested that CPMP may influence on the safety of high sugar foods when the additive amount of CPMP was more than the 95% additive amount attributed to exposed quantity beyond the ADI.

high sugar food;aryloxycarboxylic acids;sodium 2-(4-methyoxy-phenoxy)propanoate;risk assessment

2015-08-04

崔海萍(1986-)，女，硕士，工程师，主要从事食品检测及方法开发，E-mail：595598017@qq.com。

吴炜亮(1981-)，男，博士，高级工程师，主要从事食品检测及风险评估，E-mail：sonveri@163.com。

国家质检总局科技计划项目(2013QK277)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)07-0268-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.043