淫羊藿补骨脂复合胶囊毒理学研究

尹利端,彭　坚,尹利昂,王立志

(1.烟台新时代健康产业有限公司,山东烟台 264006;2.北京市经济管理学校,北京 100142;3.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)



淫羊藿补骨脂复合胶囊毒理学研究

尹利端1,彭坚2,尹利昂3,王立志1

(1.烟台新时代健康产业有限公司,山东烟台 264006;2.北京市经济管理学校,北京 100142;3.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

采用小鼠经口急性毒性实验、遗传毒性实验(Ames实验、小鼠骨髓微核实验、精子畸形实验)和大鼠30 d喂养实验,对淫羊藿补骨脂复合胶囊进行毒理学研究。结果表明,受试样品对雌、雄小鼠的最大耐受量(MTD)均大于20.0 g/kg·bw,属无毒级。Ames实验、小鼠骨髓微核实验和精子畸形实验结果均呈阴性。30 d喂养实验中,各组大鼠生长发育良好,血液学指标、生化指标、主要脏器系数、组织病理学检查均未出现异常。在实验剂量下,淫羊藿补骨脂复合胶囊是安全的。

淫羊藿,毒理学研究,功能食品

骨质疏松症是以骨量降低,骨组织显微结构发生退变,导致骨脆性增加,骨强度下降,最终使骨折危险性增大为特征的一种老年性疾病。骨质疏松症是老年人和绝经后妇女的常见病,据调查显示,截至2013年10月,我国中老年人的骨质疏松患者病人数约为5312.6万,且每年有26.3万新增患者[1]。随着我国老龄化人群的不断增加,预计至2025年骨质疏松症患病人群将可能增长至总人口的13.3%,将严重影响老年人生活质量[2]。随着人口寿命的延长和老龄化社会的到来,正有越来越多的老年人健康受到骨质疏松症的威胁。骨质疏松症患者长期服用药物会带来一定的副作用,而具有预防骨质疏松症作用的功能食品有着相对较高的食用安全性,增加骨密度功能食品已经成为近年来行业研究的热点之一。

淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥叶,补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实[3]。淫羊藿、补骨脂都具有悠久的中医药应用历史,其应用于骨病防治的功效在诸多本草典籍中均有记载。据《中华人民共和国药典》称,淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效,补骨脂具有温肾助阳作用[3]。现代研究表明,淫羊藿有雌激素样作用,具有防治骨质疏松症的功效[4-7]。补骨脂能够增加骨密度,亦具有预防骨质疏松的保健作用[8-11]。氨基葡萄糖是软骨成分蛋白聚糖合成的前体物质,具有促进关节软骨修复、改善软骨组织代谢和关节润滑的功能[12-13]。淫羊藿补骨脂复合胶囊以淫羊藿提取物、补骨脂提取物为主要原料,同时复配氨基葡萄糖盐酸盐,是针对骨质疏松人群研制的一种功能食品。为评价淫羊藿补骨脂复合胶囊的食用安全性,以进一步为产品开发提供科学参考,本研究参照《食品安全性毒理学评价程序》[14]、《保健食品检验与评价技术规范》[15],对其进行了毒理学研究。

1　材料和方法

1.1受试样品

淫羊藿补骨脂复合胶囊规格为0.3 g/粒,其制备方法为:将符合中国药典质量要求的淫羊藿、补骨脂饮片分别粉碎,过10目筛,按4∶1的质量比将其混合均匀,得混合物,向此混合物中添加10倍量纯化水,85～90℃提取2 h,共提取2次,合并2次提取液,经过滤、减压浓缩、干燥后得淫羊藿与补骨脂混合提取物;将此混合提取物与氨基葡萄糖盐酸盐、淀粉按照1∶1.5∶1的质量比混合均匀后装胶囊。

淫羊藿补骨脂复合胶囊人体推荐用量为每日2次,每次3粒,成人体重按60 kg计算,折合剂量为0.03 g/kg·bw。

1.2实验动物

SPF级昆明种小鼠和SD大鼠由中科院上海实验动物中心提供,实验动物在实验前适应性喂养7 d,动物饲养室温度(22±2)℃,相对湿度50%±10%。

1.3主要仪器与试剂

SYSmesXT-1800i全自动血球计数仪日本希思曼公司;AU680全自动生化分析系统贝克曼库尔特公司;光学显微镜日本Olympus株式会社;电子天平日本岛津公司;离心机上海卢湘仪器有限公司;电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂。

对二甲基氨基苯重氮磺酸钠(敌克松)Sigma公司;叠氮钠、2-氨基芴(2-AF)、1,8-二羟蒽醌Fluka公司;环磷酰胺上海华联制药有限公司,化学纯;甲醇、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠广东汕头市西陇化工有限公司,均为分析纯。

1.4实验方法

1.4.1小鼠急性毒性实验选用健康昆明种小鼠20只,体重18～22 g,雌雄各半。将受试样品用蒸馏水配制成0.5 g/mL的溶液,小鼠空腹16 h后,以20 mL/kg·bw容量灌胃2次,间隔为4 h,总灌胃剂量为20.0 g/kg·bw,连续观察14 d,记录小鼠的中毒表现及死亡情况。

1.4.2遗传毒性实验

1.4.2.1Ames实验采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株实验菌进行实验,用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆(S9)作为体外代谢活化系统。在无菌条件下,将受试样品用灭菌蒸馏水稀释成不同剂量后,与琼脂、实验菌液、S9混合液混合倒入平皿中。平皿中受试样品最终剂量分别为5000、1000、200、40、8 μg/皿,每个剂量组做3个平皿,同时设空白对照、溶剂对照和阳性对照(敌克松、叠氮钠、2-AF、1,8-二羟蒽醌,剂量分别为50、1.5、10、50 μg/皿)。均包括加S9和不加S9两种情况。平皿37℃培养48 h,计数每皿回变菌落数。如果受试样品回变菌落数是自发回变菌落数的2倍以上,并有剂量-反应关系者则定为阳性。整套实验在相同条件下重复一次。

1.4.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验选用健康昆明种小鼠50只,体重25～30 g,随机分为5组,每组10只,雌雄各半。设阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺,40 mg/kg·bw)和3个实验剂量组分别为2.5、5.0、10.0 g/kg·bw。受试样品剂量组配制浓度分别为0.125、0.25、0.50 g/mL。各组灌胃量均为20 mL/kg·bw,灌胃2次,间隔24 h。末次给予受试物6 h后,颈椎脱臼处死动物,取股骨骨髓加小牛血清混匀,常规涂片、固定,Giemsa染色制片。镜检观察,每鼠计数1000个嗜多染红细胞(PCE)的微核数,微核率以千分率计,在计数嗜多染红细胞(计数200个PCE)时同时计数成熟红细胞(NCE)数,计算PCE/NCE值,并进行统计分析。

1.4.2.3小鼠精子畸形实验选用雄性小鼠25只,体重30～35 g,随机分为5组,每组5只。阴性对照组(蒸馏水)、阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg·bw)和3个实验剂量组分别为2.5、5.0、10.0 g/kg·bw。将配制的不同浓度样品按20 mL/kg·bw分别对各组动物灌胃。每日1次,连续5 d。末次灌胃后30 d处死动物,取附睾制片,染色,镜检观察,每鼠计数1000个精子的畸形数,计算精子畸形发生率,并进行统计分析。

1.4.330 d喂养实验选用健康大鼠80只,体重60～80 g,随机分4组,每组20只,雌雄各半。受试样品按人体推荐量的25、50、100倍设0.75、1.5、3.0 g/kg·bw 3个剂量组,另设阴性对照组(蒸馏水)。受试样品用蒸馏水配制浓度分别为0.05、0.1、0.2 g/mL,以15 mL/kg·bw灌胃,阴性对照组灌胃等体积蒸馏水,单笼喂养,自由进食,连续30 d。每天观察并记录动物的一般情况、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量,计算每周及总的食物利用率。给予受试样品30 d后,禁食16 h处死动物,检测其血液学指标、血生化学指标、脏器系数,并进行组织病理学检查。

1.5实验数据统计

采用SPSS软件进行实验数据统计和方差分析。p<0.05表示具有显著性差异。

2　结果与分析

2.1急性经口毒性实验

将淫羊藿补骨脂复合胶囊以20.0 g/kg·bw的剂量给小鼠灌胃后,观察14 d,雌、雄小鼠均未见明显中毒症状,也无死亡。将受试动物处死进行解剖检查,肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺、胃、肠等主要脏器均未见明显异常改变。根据急性毒性分级标准,当样品对实验动物的最大耐受量大于15 g/kg·bw时属无毒级[16]。本受试样品对雌、雄小鼠的最大耐受量均大于20.0 g/kg·bw,故属无毒级。

表1　淫羊藿补骨脂复合胶囊第一次Ames实验结果±SD)

注:**表示与阴性对照组比较,具有极显著性差异(p<0.01),表2～表4同。

表2　淫羊藿补骨脂复合胶囊第二次Ames实验结果±SD)

2.2遗传毒性实验

2.2.1Ames实验Ames实验结果见表1、表2。由表1、表2可知,两次实验自发回变菌落数均在正常范围,受试样品各剂量组回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍,亦无剂量-反应关系,说明在加与不加S9时,受试样品对鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA100、TA102四株实验菌株均未呈现致突变作用。

2.2.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果见表3。由表3可知,以2.5、5.0、10.0 g/kg·bw的剂量对小鼠灌胃,受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率未产生明显改变,各剂量组微核率与阴性对照组比较不具有显著性差异(p>0.05),而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较有极显著性差异(p<0.01),表明受试样品对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率无影响,即受试样品小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果为阴性。

表3　淫羊藿补骨脂复合胶囊对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

2.2.3小鼠精子畸形实验小鼠精子畸形实验结果见表4。由表4可知,以2.5、5.0、10.0 g/kg·bw的剂量给小鼠灌胃受试样品,各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组接近,不具有显著性差异(p>0.05),而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较,具有显著性差异(p<0.01),表明受试样品对小鼠精子无致畸形作用。

表4　淫羊藿补骨脂复合胶囊对小鼠精子畸形率的影响

2.3大鼠30 d喂养实验

2.3.1淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠体重及食物利用率的影响以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的剂量连续对大鼠灌胃受试样品30 d,实验周期内各剂量实验动物生长状况良好,体重逐周增长,未见中毒体征及死亡。动物体重增加量、进食量和食物利用率见表5。由表5可知,各剂量组动物体重增加量、进食量和食物利用率与阴性对照组比较,均无显著性差异(p>0.05),表明受试样品对大鼠体重、进食量和食物利用率均无影响。

表5　淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠体重、进食量和食物利用率的影响±SD)

2.3.2淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠血液学指标的影响以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的剂量连续对大鼠灌胃受试样品30 d后,测定各剂量组大鼠血液学指标红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类。测定结果见表6。由表6可知,各剂量组大鼠血液学指标均在正常范围,与阴性对照组比较均无显著性差异(p>0.05),表明受试样品对大鼠血液学指标无影响。

表6　淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠血液学检指标的影响±SD)

2.3.3淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠血生化指标的影响以0.75、1.5、3.0 g/kg·bw的剂量连续对大鼠灌胃受试样品30 d后,测定各剂量组大鼠血生化指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、血糖、尿素氮、肌酐。测定结果见表7。由表7可知,各剂量组大鼠血生化指标均在正常范围内,与阴性对照组比较均无显著性差异(p>0.05),表明受试样品对大鼠血生化指标无影响。

2.3.4大体解剖及组织病理学检查结果各剂量组大鼠大体检查未见异常,雌、雄大鼠的肝脏、脾脏、肾脏、睾丸、卵巢的重量及脏体比与阴性对照组比较,均无显著性差异(p>0.05)。对高剂量组和阴性对照组大鼠主要脏器进行组织病理学检查,阴性对照组(雌1/10只)、高剂量组(雄1/10只)观察到肝小叶有点状的炎细胞浸润灶。由于肝脏病变程度较轻且无组间特异性分布,考虑与动物质量有关。肾、脾、胃、十二指肠、卵巢、睾丸等脏器未见明显异常。与阴性对照组相比,实验组动物未出现有意义的病理改变。

表7　淫羊藿补骨脂复合胶囊对大鼠血生化指标的影响±SD)

3　结论

淫羊藿补骨脂复合胶囊对雌、雄小鼠最大耐受量均大于20.0 g/kg·bw,根据急性毒性分级标准,属无毒级。本研究进行的三项遗传毒性实验(Ames实验、小鼠骨髓细胞微核实验、小鼠精子畸形实验)均呈阴性,表明淫羊藿补骨脂复合胶囊无遗传毒性。在大鼠30 d喂养实验中,动物生长发育良好,动物的体重、进食量、食物利用率、血液学指标、血生化学、主要脏器系数和器官组织形态等均未出现异常变化。综合本研究结果,在实验剂量下,淫羊藿补骨脂复合胶囊作为功能食品是安全无毒的。

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Toxicological study on compound capsule of epimedium and psoraleae

YIN Li-duan1,PENG Jian2,YIN Li-ang3,WANG Li-zhi1

(1.Yantai New Era Health Industry Co.,LTD,Yantai 264006,China; 2.Beijing Economic Management School,Beijing 100142,China; 3.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Acute toxicity test in mice,genetic toxicity tests(Ames test,micronucleus test of bone marrow and sperm abnormality in mice),and 30-days feeding test in rats were conducted to study toxicity of compound capsule of epimedium and psoraleae.The results showed that the MTD of the tested sample to the female and male mice were more than 20.0 g/kg·bw,so compound capsule of epimedium and psoraleae was no toxicity.Ames test,bone marrow micronucleus test and sperm abnormality test in mice were all negative.In 30-day feeding test,all groups of rats of different doses grew well,hematology indexes,blood biochemistry indexes,main organ coefficient and histopathological examination were all normal.It was concluded that compound capsule of epimedium and psoraleae was safe under the test dose.

epimedium;toxicological study;functional foods

2015-09-02

尹利端(1979-)，男，硕士，工程师，研究方向：功能食品的研究、开发与产业化，E-mail:yinduan@sohu.com。

TS201.6

A

1002-0306(2016)07-0350-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.059