发酵土鳖虫总黄酮含量的测定及方法学考察

王立娜，马明珠，王集会

(1.山东中医药大学药学院，山东济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东济南 250355 )



发酵土鳖虫总黄酮含量的测定及方法学考察

王立娜1，马明珠1，王集会2*

(1.山东中医药大学药学院，山东济南 250355；2.山东中医药大学实验中心，山东济南 250355 )

[目的]研究发酵土鳖虫含水醇提物中总黄酮含量的测定方法，并对其方法学进行考察。[方法]采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法在510 nm处测定黄酮类化合物与显色剂所形成的络合物吸光度。[结果]所测定标准曲线线性相关性良好，r=0.999 0，线性范围在0.02～0.10 mg/mL，试验方法的精密度RSD=1.92%，重现性RSD=1.23%，样品回收率95.00%±10.00%，RSD=2.09%。样品重复测定总黄酮含量平均值为4.630 8 mg/g。[结论]方法学考察结果表明，用紫外分光光度法测定发酵土鳖虫总黄酮类化合物含量的标准曲线和线性范围、精密度、准确度和重复性等项内容都符合相关规定，该方法准确可靠，可用于含量测定。

发酵土鳖虫；黄酮络合物；方法学考察

土鳖又名土元、地鳖，是鳖蠊科昆虫中华真地鳖(EupolyphagasinensisWalker )和冀地鳖(PolyphagaplancyiBolivar)的雌体。味咸，性寒，有小毒，能入肝、心、脾三经，其药用最早记载于秦汉时代的《神农本草经》，是我国传统的中药材，具有活血散瘀，消肿止痛等功效[1]。现代药理试验研究充分表明了土鳖虫能够抗肿瘤、抗凝血、溶解血栓以及抑制血小板聚集等功效[1]。

白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill]是一种丝状真菌，属于半知菌亚门，在其生长过程中可产生多种次生代谢物质，包括蛋白质、多糖、白僵菌素、黄酮等，具有一定抗肿瘤活性。白僵菌孢子接触昆虫后，在适宜的温度条件下萌发，生长菌丝侵入虫体内进行发酵，而虫类发酵可以利用微生物在生长过程中产生的强大酶系如蛋白酶糖化酶等将虫类中药中所含有的蛋白、多糖、黄酮等成分转化修饰成活性更强的物质，从而发挥更大的药效，增加有效成分利用率。有学者从中华真地鳖石油醚部分得到1种黄酮类化合物[2]，而白僵菌在发酵过程中也会产生较多黄酮，土鳖虫中所含的黄酮类化合物与白僵菌的生长、代谢存在相互作用，进而改变其含量。目前国内外对发酵土鳖虫黄酮类化合物的研究未见资料报道。因此该试验以球孢白僵菌为发酵菌，将其接种在土鳖虫粉上，采用新型固体双向发酵模式对土鳖虫进行深层加工，建立了球孢白僵菌与土鳖虫二者相互作用后所转化的黄酮类化合物含量测定的紫外分光光度法，并进行了方法学考察，以期为从发酵土鳖虫粉中提取黄酮类化合物并加以利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药材与试剂。发酵土鳖虫粉(山东中医药大学实验室自制，批号20150501)，经山东中医药大学高德民老师鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖(EupolyphagasinensisWalker)；白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill]孢子粉(100亿/g，山东省农业科学院植物保护研究所自筛选菌株——桃 5)；芦丁标准品(CHENGDU MUST BIO-TECHNOLOGY CO，LTD.含量≥98.00%，UV)、氢氧化钠、亚硝酸钠、六水氯化铝、乙醇皆为分析纯。

1.1.2仪器。UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；TDZ5-WS台式多管低速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)；FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1发酵土鳖虫粉的制备。精密称取一定量的土鳖虫干粉，取1.000 0 g白僵菌孢子粉，加少量吐温-80，用适量灭菌水将其稀释成为每毫升含1×108个孢子的混悬液，取适量，拌匀润湿，25～28 ℃，湿度为95%，在恒温恒湿培养箱中发酵8 d左右，待长满菌丝后停止发酵。

1.2.2含量测定及方法学考察[3]。

1.2.2.1芦丁标准品溶液的配制。精密称取芦丁对照品20 mg，用60%乙醇溶解后，移入100 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，即浓度为0.20 mg/mL的标准溶液，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2.2标准曲线的绘制。分别量取标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 ml试管中，补加30%乙醇至5 mL，再加5%的亚硝酸钠溶液300 μL，摇匀后静置6 min；然后加10%的六水氯化铝600 μL，摇匀后静置5 min，最后加入1.0 M的氢氧化钠溶液，并用30%乙醇稀释至刻度。然后在波长510 nm处测定吸光度，以芦丁浓度(Y)对吸光度(X)进行回归分析，制作标准曲线。

1.2.2.3含量测定。精确称取发酵土鳖虫粉2.000 0 g，加入60 mL 80%浓度的乙醇溶液，先超声波震荡处理20 min，于100 ℃的温度下回流2.5 h。将黄酮粗提液抽滤，弃去残渣，收集滤液。然后将滤液于4 ℃下8 000 r/min离心20 min，收集上清液入50 mL容量瓶，用30%浓度的乙醇定容至刻度。精确吸取2 mL，按照前文所述方法，自“加30%乙醇至5 mL”起，依次测定吸光度，通过回归方程求得待测样品溶液中黄酮的浓度(C)。

1.2.2.4样品的精密度考察。准确称取发酵土鳖虫粉样品2.000 0 g，按“1.2.2.3”项下方法进行提取和制备溶液，精确吸取同一批试样液平行测定 5次，每次2 ml，分别用紫外分光光度法测定510 nm下其黄酮类化合物的吸光度(A510)并计算相对标准误差RSD。

1.2.3.5重现性考察。准确称取发酵土鳖虫粉样品5份，每份2.000 0 g，按“1.2.2.3”项下方法进行提取和制备溶液，重复测定5次。

1.2.2.6黄酮化合物的回收率测定。准确称取已测知总黄酮含量的发酵土鳖虫粉样品5份，每份2.000 0 g，各加入5.00 mg的芦丁标准对照品，按“1.2.2.3”项下方法进行提取和制备溶液，并进行测定。

2　结果与分析

2.1标准曲线的绘制由图1可知，建立的回归方程为：Y=1.123 1x，r=0.999 0。结果表明，芦丁(黄酮类化合物)浓度在0.02～0.10 mg/mL范围内，其浓度与对应的吸光度呈现良好的线性关系，符合Lambert-Beer定律，根据吸光度来计算其含量是可靠的。

图1　芦丁标准曲线方程Fig.1　Equation of rutin standard curve

2.2样品的精密度连续5次测定吸光值，样品中黄酮含量分别为4.578 1、4.562 5、4.532 1、4.489 1、4.721 3、4.545 3，RSD=1.92%(n=5)。结果表明，样品精密度良好。

2.3方法的重现性对方法的重现性考察结果(表1)，表明，该方法重现良好，RSD<1.50%。

表1　重现性试验

2.4黄酮化合物的回收率表2表明，土鳖虫样品中黄酮化合物的回收率为95.00%±10.00%，其平均值为99.82%，RSD=2.09%(n=5)。

表2　回收率试验

2.5样品总黄酮含量试验结果表明，样品重复3次测定的总黄酮含量平均值为4.6308，RSD为2.37%。

3　讨论

该试验采用NaNO2-AlCl3-NaOH显色剂与发酵土鳖虫中的总黄酮发生络合反应，生成吸光物质，然后通过紫外分光光度法测定了发酵土鳖虫中总黄酮类化合物含量，并进行方法学考证。结果表明，该方法可靠、准确，重现性好，稳定性强，并且操作简便、快速，可用于发酵土鳖虫黄酮类化合物含量的测定，同时也为从发酵土鳖虫粉中提取黄酮类化合物并加以利用提供了理论依据。但是发酵土鳖虫存在的黄酮类化合物往往是混合物而非单一组分，用紫外分光光度法测定的黄酮类化合物含量，有可能是黄酮及其异构体的总量，如多聚酮、异黄酮等。因此将来有必要探索分离度高的测定方法，如高效液相色谱法、薄层扫描法等。

目前关于虫类中药的发酵炮制制药研究报道并不多见。白僵菌在土鳖虫这个天然固体培养基上的生长、代谢会发生一系列复杂的分解合成反应，产生新的成分和新的功能，使发酵的作用从原来仅具营养作用的培养基变为真菌对培养基的分解、转化、修饰、互相影响的双向型固体发酵模式，从而产生多种次生代谢产物，如蛋白质、多糖、白僵菌素、黄酮等，而且这些生物大分子化合物均具有一定的抗肿瘤、抗病毒等多种药效。尤其在发酵过程中会产生许多黄酮类化合物，这些物质能够通过清除氧自由基抗衰老、抑制癌细胞的生长、诱导肿瘤细胞调亡、降低心血管疾病以及增强机体免疫力等药理活性[4]。因此发酵后的土鳖虫在抗肿瘤、抗病毒、降低心血管系统疾病的药理活性方面应该会有某些变化，有待于进一步研究。

[1] 杨耀芳，杨翊雯，王赛前，等.土鳖虫口服液镇痛、活血化瘀与红细胞免疫研究[J].中成药，2003，25(6)：496-498.

[2] 金向群，严铭铭，黄恩喜，等.土鳖虫脂溶性成分的研究[J].中国中药杂志，1993，18(6)：355-356.

[3] 蒋学.白僵蚕活性成分分离纯化及其药理作用的研究[D].杭州：浙江大学，2013

[4] 张楫.天然黄酮类化合物的合成研究[D].昆明：昆明理工大学，2014.

[5] HU C Q，CHEN K，SHI Q，et al.Anti-AIDS agents.10.acacetin-7-O-beta-D-galactopyranoside，an anti-HIV principle from chrysanthemum-morifolium and a structure-activity correlation with some related flavonoids[J].Journal of natural products，1994，57(1)：42-51.

Determination and Methodological Investigation on the Total Flavonoids Content in FermentedEupolyphagasinesisWalker

WANG Li-na1, MA Ming-zhu1,WANG Ji-hui2*

(1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, Shandong 250355; 2. The Experiment Center, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, Shandong 250355)

[Objective] To detect the total flavonoids content in ethanol extracts from fermentedEupolyphagasinesisWalker, and to investigate the methodology. [Method] NaNO2-AlCl3-NaOH colorimetry was used to detect the complex absorbance formed by flavonoids compounds and color developing agent. [Result] The detected standard curve had good linear correlation,r= 0.999 0. The linear range was between 0.02 and 0.10 mg/mL. The precision of the test wasRSD=1.92%; repeatability wasRSD= 1.23%; sample recovery rate was 95.00%±10.00%,RSD=2.09%. The average content of total flavonoids was 4.630 8 mg/g. [Conclusion] Results of methodological investigation showed that the standard curve, linear range, precision, accuracy and repeatability of total flavonoids content in fermentedE.sinesisall meet the requirements of relevant provisions, which are detected by ultraviolet spectrophotometry. This method is accurate, reliable and can be used for content detection of total flavonoids.

FermentedEupolyphagasinesisWalker; Flavonoids complex compound; Methodological investigation

山东中医药大学大学生研究训练(SRT)计划资助项目(2015325)。

王立娜(1996-)，女，山东临沂人，本科，专业：制药工程。*通讯作者，副教授，从事虫类中药发酵及活性成分研究。

2016-05-30

R 282.74

A

0517-6611(2016)21-095-03